譚鄧旭 張彩勤 趙寧寧 張 賀 趙 勇 白 冰 師長宏

(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率高居全球前三位[1-2]。隨著HBV患者逐年增多，肝癌的發(fā)病率也在不斷增加[3-4]。肝癌早期診斷仍較困難[5]，確診時(shí)多為晚期，術(shù)后5年生存率也只有10%～20%[6-7]。因此建立模擬臨床特征的肝癌動(dòng)物模型對研究肝癌的發(fā)生機(jī)制、早期診斷、術(shù)中導(dǎo)航和新型治療方法的評估具有重要的意義。

基于臨床新鮮肝癌腫瘤標(biāo)本建立的(patient-derived xenograft, PDX)模型，可以準(zhǔn)確地反映患者腫瘤特性[8-9]。進(jìn)一步將腫瘤組織移植到與原發(fā)部位相應(yīng)動(dòng)物器官的原位移植(patient-derived orthotopic xenograft，PDOX)可提供適合腫瘤生長的體內(nèi)微環(huán)境；有利于腫瘤特異性抗原的表達(dá)，維持腫瘤的異質(zhì)性；由于移植部位血供豐富，有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。與皮下移植相比，PDOX模型更準(zhǔn)確、客觀地模擬人體腫瘤的體內(nèi)演進(jìn)過程，易形成與臨床腫瘤相似的轉(zhuǎn)移特征。因此我們擬在建立肝癌PDX模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用原位移植的方法建立PDOX模型，通過小動(dòng)物活體成像和PET/CT評估模型的特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性NPG小鼠，5只，8周齡，體質(zhì)量25～27 g，由北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2014～0001]；SPF級雄性裸鼠，20只，8周齡，體質(zhì)量23～25 g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(蘇)2016-0010]，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物設(shè)施[SYXK(陜)2014-001]。設(shè)施內(nèi)溫度22～24 ℃，相對濕度35%～45%，12 h晝夜交替，飲用水為高壓滅菌水，動(dòng)物自由攝食飲水。

本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過了第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號：14013)。肝癌腫瘤標(biāo)本(編號：C34566)來自第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院，腫瘤標(biāo)本的獲取經(jīng)過了患者本人及家屬同意，并簽署知情同意書，僅供實(shí)驗(yàn)研究。人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)通過了西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號：2015432)。

1.2 設(shè)備及試劑

Caliper Lumina II小動(dòng)物活體成像儀(Caliper公司，美國)，異氟烷麻醉劑(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，小動(dòng)物PET-CT(Mediso公司，匈牙利)，光學(xué)顯微鏡(Olympus)，近紅外熒光染料IR-783由美國Cedars Sinai Medical Center Leland Chung 教授饋贈(zèng)[10-11]，18F-FDG由西京醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供，基質(zhì)膠購自美國BD公司，CEA和AFP抗體由英國abcam公司提供，羊抗鼠免疫組化試劑盒(康為世紀(jì)，中國)，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，中國)，蘇木精和伊紅染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，中國)，組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，中國)。

1.3 肝癌 PDX模型的建立

新鮮肝癌手術(shù)標(biāo)本置于10%胎牛血清、1%青鏈霉素1640培養(yǎng)基中，用冰盒快速運(yùn)輸至動(dòng)物房。手術(shù)器械提前高壓滅菌處理。超凈臺(tái)內(nèi)標(biāo)本拿出置于一次性無菌培養(yǎng)皿，用剪刀將標(biāo)本處理至直徑1 mm左右小塊與等量基質(zhì)膠1∶1混勻置于冰上。異氟烷麻醉5只NPG小鼠，手持電動(dòng)剃毛機(jī)將小鼠背部接種部位毛發(fā)剃除，用酒精棉消毒并去除殘留毛發(fā)，將與基質(zhì)膠混勻的腫瘤標(biāo)本置于套管針內(nèi)，于小鼠背部皮下注入，傷口用5-0縫合針線縫合，用碘伏消毒創(chuàng)口后放回籠盒觀察，命名為P0代。

1.4 PDX模型組織病理學(xué)、腫瘤標(biāo)志物IHC及STR溯源評估

待腫瘤生長至1 000 mm3(腫瘤長度(l)和寬度(w)，腫瘤體積(V)，計(jì)算公式為：V=1/2 ×(w2×l))左右，異氟烷麻醉生長有腫瘤組織的1只NPG小鼠，腫瘤部位剃毛，酒精消毒后做表皮切口，取腫瘤組織置于一次性無菌培養(yǎng)皿，傷口重新縫合并消毒后放回飼養(yǎng)籠盒。將取出的腫瘤組織分為三份：一份用4%多聚甲醛固定，做病理及相關(guān)腫瘤標(biāo)志物IHC檢測使用；一份使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，酶標(biāo)儀測定DNA濃度為100 ng/mL，然后用蒸餾水稀釋至5 ng/mL，送至第四軍醫(yī)大學(xué)司法鑒定中心進(jìn)行STR(short tandem repeat)溯源檢測；第三份腫瘤組織保證無菌，將其切成1 mm3腫瘤塊以備PDX傳代和PDOX模型制備使用。異氟烷麻醉生長有腫瘤組織的其余4只NPG小鼠，取出腫瘤組織用于組織凍存以及在10只裸鼠皮下的傳代。

組織病理學(xué)觀察：將4%多聚甲醛固定超過24 h的腫瘤標(biāo)本，進(jìn)行石蠟包埋切片，HE染色封片晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察。

肝臟腫瘤標(biāo)志分子(AFP、CEA)的IHC檢測：組織切片二甲苯完全脫蠟；抗原修復(fù)；Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10～15 min降低內(nèi)源性過氧化物酶；滴加 Ultra V Block封閉非特異性的背景染色；一抗AFP、CEA 分別37 ℃孵育2 h，加入二抗(羊抗鼠)室溫孵育20 min，DAB顯色后，蘇木精復(fù)染脫水透明封片晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 肝癌PDOX模型的建立

離體腫瘤組織在一次性無菌平皿修剪盡可能小，36 ℃膠原蛋白酶和分散酶消化腫瘤組織20 min，期間每5 min震蕩混勻一次，加入血清終止消化，1 000 r/min離心去上清后加入基質(zhì)膠和少量1640培養(yǎng)基懸浮腫瘤組織置于冰面。異氟烷麻醉10只裸鼠，仰臥固定，上腹部消毒；于小鼠劍突下緣處做1 cm橫向切口，充分暴露肝臟；用鈍頭鑷子將一頁肝小心牽拉出體外，將懸浮腫瘤組織吸入5 mL注射器內(nèi)，肝臟穿刺并注入適量懸浮腫瘤組織，撤離針頭迅速用無菌脫脂棉按壓。小心將肝臟放回體內(nèi)，縫合腹壁和表皮，傷口消毒置回籠盒，完成組織懸液PDOX模型制作。

1.6 肝癌PDOX模型的活體成像及腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察

肝癌PDOX模型建立4周后，對模型鼠進(jìn)行腹腔注射NIRF染料IR-783(100 μmol/L，100 μL/只)，24 h后通過Caliper Lumina II小動(dòng)物活體成像儀檢測模型鼠肝臟部位的腫瘤熒光信號。

解剖分離臟器和腫瘤分別進(jìn)行成像，查看染料在小鼠臟器和腫瘤各部位的分布情況。最后將肝臟的腫瘤部分用4%多聚甲醛固定后，做組織病理學(xué)HE染色觀察。

1.7 肝癌PDOX模型PET/CT檢測

將肝臟部位有明確熒光信號的模型鼠送至西京醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科進(jìn)行小動(dòng)物PET/CT檢測。模型鼠尾靜脈注射18F-FDG顯影劑150～200 μCi/只，注射后體內(nèi)代謝1 h[10-11]，再使用異氟烷呼吸麻醉裸鼠后進(jìn)行PET/CT 全身掃描； 掃描結(jié)束后3D圖像的構(gòu)建利用Nuclinenano Scan軟件(Mediso公司)完成。

2 結(jié)果

2.1 肝癌 PDX腫瘤組織STR溯源檢測和組織形態(tài)病理結(jié)果

選取16個(gè)人源化STR位點(diǎn)聯(lián)合檢測。檢測結(jié)果顯示，該16個(gè)人源化位點(diǎn)均被檢出(圖1A)，可以確定該腫瘤的人源性。PDX組織H&E染色見圖1B，患者源發(fā)腫瘤和PDX進(jìn)行比較，組織形態(tài)基本相似：細(xì)胞呈現(xiàn)多面體形；細(xì)胞核居中，大且圓，部分可見雙核，常染色質(zhì)豐富，符合肝癌組織病理特征。肝癌特異性標(biāo)志物AFP和CEA在原發(fā)瘤和移植瘤中均陽性表達(dá)，提示PDX模型較好地保存了原發(fā)瘤的遺傳和病理學(xué)特征。

2.2 肝癌PDOX模型的活體成像結(jié)果

圖2A顯示了小動(dòng)物活體成像儀檢測的近紅外熒光染料IR-783成像結(jié)果。IR-783在24 h后在肝臟部位富集，熒光信號只是在腫瘤部位顯像，并不是整個(gè)肝臟區(qū)域均有熒光信號。

PET/CT檢測后麻醉處死模型鼠，取心、肝、脾、肺、腎等臟器組織進(jìn)行近紅外熒光成像，圖2C中明顯可見IR-783染料主要富集在肝臟下緣的腫瘤部位，肝、腎等主要的代謝器官無富集。

制備的10只裸鼠肝癌PDOX模型，在成像結(jié)束后，將模型鼠安樂死后解剖發(fā)現(xiàn)，其中有兩只裸鼠接種的腫瘤生長在腹腔內(nèi)壁，其余8只均生長在裸鼠的肝臟中。模型制備成功率為80%左右(8/10=80%)。

2.3 PET/CT評估PDOX建模狀況

PET/CT檢測結(jié)果如圖2B所示，除腦、心、肺、脊柱、膀胱顯示較強(qiáng)信號，這些部位顯示信號強(qiáng)是由于糖代謝水平高。此外，小鼠肝臟部位局部也可見明顯信號(見圖2B中紅色圓圈 處)，此信號部位即為肝腫瘤部位。

2.4 肝癌PDOX模型的組織形態(tài)觀察

組織塊直接植入后可見腫瘤組織生長于小鼠肝臟，表面可見光滑包膜，邊緣較清晰，未見彌漫生長，無可見轉(zhuǎn)移灶。組織病理形態(tài)觀察，腫瘤邊界較清晰，正常肝臟內(nèi)腫瘤細(xì)胞浸潤不明顯，圖3中紅色箭頭所指區(qū)域即是原位移植的局限性生長的腫瘤。

圖3 肝癌PDOX模型腫瘤樣本的HE染色結(jié)果Fig.3 HE staining results of PDOX tumorsample from liver cancer

3 討論

成功建立的PDX模型必須確保與原發(fā)瘤的組織形態(tài)和遺傳特征相似。本研究使用肝癌患者新鮮腫瘤標(biāo)本建立了皮下移植模型，分別從組織病理形態(tài)、腫瘤標(biāo)志物和STR分型對移植瘤組織進(jìn)行了分析，確認(rèn)了與原發(fā)瘤的相似性，明確肝癌PDX模型的成功建立(見圖1)。進(jìn)一步將PDX模型的瘤組織進(jìn)行原位移植，提供與原發(fā)瘤相似的生長環(huán)境，有利于腫瘤特異性抗原的表達(dá)，維持腫瘤的異質(zhì)性，采用HE染色的方法確認(rèn)了組織形態(tài)的一致性(見圖3)。

與皮下移植瘤不同，肝臟原位移植瘤無法用肉眼觀察，只能等到動(dòng)物發(fā)生明顯的體征后才能確認(rèn)腫瘤的發(fā)生。而小動(dòng)物分子影像技術(shù)則提供了有效方法對臟器內(nèi)腫瘤進(jìn)行有效評估，如MRI、PET和近紅外熒光(near infrared fluorescence，NIRF)活體成像。相比于前兩種方法，NIRF 活體成像特異性強(qiáng)，背景干擾小，方便直觀。常規(guī)NIRF技術(shù)通過將NIRF染料標(biāo)記腫瘤特異性的靶向片段，使用光學(xué)設(shè)備檢測生物體內(nèi)熒光信號，可實(shí)現(xiàn)對癌細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測。PDX模型由于是瘤組織移植，無法進(jìn)行特異性標(biāo)記。我們實(shí)驗(yàn)室與美國的Leland W.K. Chung教授合作發(fā)現(xiàn)一類七甲川菁(Heptamethine cyanine)近紅外熒光染料，如IR-783和MHI-148可特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，不需標(biāo)記探針可直接用于腫瘤模型的活體成像，具有成像和靶分子的雙重功能[11]。先前的研究中證實(shí)了該類染料具有多種腫瘤的靶向性，如前列腺癌、乳腺癌、腎癌等[10-12]，其靶向機(jī)制可能是有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽(organic anion-transporting peptides，OATPs)介導(dǎo)了該類染料的吸收[13]。本研究結(jié)果表明在原位移植30 d后，通過腹腔注射IR-783可以清晰觀察到肝臟部位熒光信號的聚集，進(jìn)一步通過離體實(shí)驗(yàn)確認(rèn)肝臟腫瘤的發(fā)生(見圖2)。

小動(dòng)物PET用于臟器內(nèi)腫瘤檢測具有良好的靈敏度。本研究將功能代謝顯像(PET)和組織結(jié)構(gòu)顯影(CT)兩種分子影像技術(shù)結(jié)合起來進(jìn)行PET/CT雙模態(tài)成像系統(tǒng)。由于腫瘤細(xì)胞代謝旺盛，糖代謝水平高于正常肝組織，靜脈注射18F標(biāo)記的氟代脫氧葡萄糖(fluorodeoxyglucose，F(xiàn)DG)。腫瘤對標(biāo)記核素的高攝取通過PET/CT顯像可準(zhǔn)確判斷腫瘤位置甚至腫瘤大小[14-15]。PET/CT顯像結(jié)果顯示，除了代謝旺盛器官如腦、心、脊柱等之外，在腹部肝區(qū)，明顯看到核素富集，輪廓清晰，區(qū)別于正常肝組織(見圖2B)。定期進(jìn)行PET/CT檢測，可以準(zhǔn)確判定腫瘤生長轉(zhuǎn)移等情況，實(shí)現(xiàn)對模型動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的實(shí)時(shí)監(jiān)測。

綜上所述，本研究中建立的肝癌PDOX模型，較好地保留了原發(fā)病人的腫瘤特異性和異質(zhì)性，是進(jìn)行肝癌發(fā)病機(jī)制研究以及治療藥物篩選研究的良好動(dòng)物模型。