原代小鼠卵巢上皮細(xì)胞TP53基因敲除及其生物學(xué)特征變化*

張 濤 范君文 李 丹 李文龍 孫兆增 賀喜兵 曾 林 邱業(yè)峰

(軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071)

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 及其相關(guān)的Cas基因系統(tǒng)是最新涌現(xiàn)的一種基因組編輯工具，因其操作簡便、效率高而成為熱門的基因編輯技術(shù)。該系統(tǒng)是細(xì)菌和古生菌抵抗外源基因侵入的獲得性免疫系統(tǒng)，侵入宿主的噬菌體或質(zhì)粒 DNA片段整合到 CRISPR 位點(diǎn)，然后在 CRISPR RNAs (cr RNAs) 引導(dǎo)下由Cas 核酸內(nèi)切酶切割外源侵入DNA序列[1]，造成DNA 雙鏈斷裂，DNA雙鏈斷裂后激活細(xì)胞的同源末端重組或非同源末端連接機(jī)制對(duì)斷裂的 DNA 進(jìn)行修復(fù)，達(dá)到對(duì)基因組定點(diǎn)修飾的作用[2]。Cas 基因編碼的蛋白具有核酸酶和解旋酶結(jié)構(gòu)域[3]。在Cas 基因附近有一段幫助 cr RNAs 成熟的轉(zhuǎn)錄活化 RNA (Trans-activating cr RNA，tracr RNA)，tracr RNA 促進(jìn) pre-cr RNA 的成熟，形成具有切割活性的 cr RNA-tracr RNA-Cas9三元復(fù)合體[4]。與鋅指核酶(ZFN)以及轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù)相比，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)具有操作更簡便、靶點(diǎn)選擇更靈活、活性更高等優(yōu)勢(shì)。

TP53為含鋅轉(zhuǎn)錄因子，直接作用或間接調(diào)節(jié)其下游基因的表達(dá)，在DNA修復(fù)、細(xì)胞周期捕獲、細(xì)胞凋亡、分化等過程中起重要作用[5- 6]。腫瘤抑制基因TP53在人類癌癥發(fā)生中突變頻率最高[7]，該基因?yàn)轱@性失活，一個(gè)等位基因滅活就可以導(dǎo)致TP53基因功能失活[8]。TP53基因突變與功能喪失是卵巢癌中最常見的基因異常之一，卵巢癌患者中約26%～62%存在該基因突變，約50%的晚期卵巢癌患者p53蛋白功能失活，主要為漿液性、低分化卵巢癌[9- 10]。

本研究利用CRISPR/Cas9慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建TP53基因敲除小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞系，并對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行分析。為構(gòu)建該基因敲除動(dòng)物模型、研究卵巢癌的發(fā)生機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑：DMEM、FBS、雙抗以及胰酶購自Gibco公司，P53、β-actin一抗 購于Santa cruz公司，PCR試劑盒、BsmBI內(nèi)切酶、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipfectamine 2000購自Invitrogen公司，T4DNA 連接酶、T4 PNK購自NEB公司，SAP(蝦堿性磷酸酶)購自MBI Fermentas公司，質(zhì)粒提取試劑盒購于Qiagen公司。

1.1.2質(zhì)粒與菌株：LentiCRISPRv2載體購自Addgene公司；DH5α感受態(tài)菌，購自天根公司。

1.1.3細(xì)胞：小鼠卵巢上皮細(xì)胞，C57BL/6 Mouse Primary Ovarian Epithelial Cells購自Cell Biologics，Catalog No. C57-6036；293FT細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1gRNA設(shè)計(jì)：在GenBank找到TP53基因(NC_000077)外顯子序列，利用CRISPR設(shè)計(jì)平臺(tái)http://crispr.mit.edu/設(shè)計(jì)gRNA引物，并進(jìn)行脫靶分析。

1.2.2LentiCRISPRv2-sgRNA構(gòu)建：LentiCRISPRv2質(zhì)粒經(jīng)BsmBⅠ酶切線性化并且去磷酸化處理，引物退火及磷酸化處理后與線性化載體16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.3慢病毒包裝：LentiCRISPRv2-sgRNA質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pCMV-VSVG、psPAX2共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，4 h后更換培養(yǎng)基，60 h后收集上清，分裝后-80 ℃保存。

1.2.4蛋白免疫印跡：細(xì)胞經(jīng)RIPA buffer 裂解，離心取上清。80μg 蛋白上樣于10% SDS-PAGE凝膠，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，p53蛋白一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗3次，5 min/次，室溫孵育二抗1 h，洗膜后顯影。

1.2.5免疫熒光染色：細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，PBST清洗后室溫封閉(5%山羊血清，1%BSA，0.1%Triton-X 100溶解于PBS)1 h，一抗(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜，PBST清洗后室溫避光孵育二抗(1∶200稀釋)1 h，加入DAPI，熒光顯微鏡下采集圖片。

1.2.6細(xì)胞增殖：MTT試劑盒測定，96孔板每孔接種8×103個(gè)細(xì)胞，每組4個(gè)重復(fù)，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，每孔加入10 μL MTT試劑培養(yǎng)4 h后加入100 μL 裂解液，室溫避光孵育2 h，讀取570 nm 吸光度A值。

1.2.7細(xì)胞遷移測定：transwell 小室進(jìn)行測定，每個(gè)上室中接種5×104個(gè)細(xì)胞，懸浮于500 μL 無血清DMEM中，每組3個(gè)重復(fù)，下室加入500 μL 10%FBS DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 擦去未遷移的細(xì)胞，HE染色，電子顯微鏡下拍照。

1.2.8細(xì)胞侵襲測定：transwell 小室中預(yù)先鋪一層matrigel基質(zhì)膠，上室中接種8×104個(gè)細(xì)胞，懸浮于500 μL 無血清DMEM中，每組3個(gè)重復(fù)，下室加入500 μL 10%FBS DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)30 h 擦去基質(zhì)膠及未穿過的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，電子顯微鏡下拍照。

1.2.9細(xì)胞克隆形成分析：6孔板接種400個(gè)細(xì)胞/每孔，每組3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)14 d后結(jié)晶紫染色，電子顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)克隆數(shù)量。軟瓊脂克隆采用0.8%的瓊脂懸浮3x104個(gè)細(xì)胞/每孔，接種于6孔板中，每組3個(gè)重復(fù)，下層凝膠濃度為1.4%，每2 d補(bǔ)液200 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，每孔加入20 μL MTT 試劑(10 mg/mL)培養(yǎng)12 h，電子顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng) 計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 LentiCRISPRv2-sgRNA TP53構(gòu)建及PCR驗(yàn)證

設(shè)計(jì)的sgRNA序列為：F 5′-CACCGGTGTAATA GCTCCTGCATGG-3′，R 5′-AAACCCATGCAGGAGC TATTACACC-3′，退火及磷酸化后與線性化載體LentiCRISPRv2連接，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，所用引物上游為LentiCRISPRv2上LKO.1_5的序列，下游為sgRNA序列，即：LKO.1_5 F5′-GACTATCATATGCTTACCGT-3′,TP53 R5′-AAACC CATGCAGGAGCTATTACACC-3′，擴(kuò)增片段大小200 bp。

2.2 TP53基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞株的建立

用病毒液感染小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞，得到TP53基因敲除細(xì)胞，并通過1 μg/mL嘌呤霉素篩選獲得該基因穩(wěn)定敲除的細(xì)胞系。對(duì)照組細(xì)胞為轉(zhuǎn)導(dǎo)空載體的細(xì)胞。蛋白免疫印跡表明，TP53基因敲除細(xì)胞株中p53蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比顯著降低(圖1 A)，免疫熒光顯示TP53基因敲除細(xì)胞系幾乎不表達(dá)p53蛋白(圖1B)，獲得了TP53基因完全敲除的小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞系。

圖1 TP53基因敲除細(xì)胞p53表達(dá)顯著降低注:A. p53蛋白表達(dá)；Con，對(duì)照組；KO，TP53基因敲除組；B. p53蛋白免疫熒光染色×200Fig.1 the expression of p53 in TP53 gene knockout cells decreased significantlyNote:A. p53 protein expression；Con，control group；KO，TP53 gene knockout group；B. Immunofluorescence staining of p53 protein×200

2.3 TP53基因敲除促進(jìn)細(xì)胞增殖

小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞TP53基因敲除后增殖旺盛。與對(duì)照組相比，TP53基因敲除細(xì)胞系的增殖速度顯著升高(圖2A)，第4天時(shí)該組細(xì)胞密度明顯多于對(duì)照組(圖2B)。

圖2 TP53基因敲除促進(jìn)細(xì)胞增殖注:A. 細(xì)胞增殖曲線；Con，對(duì)照組；KO，TP53基因敲除組；與同時(shí)間對(duì)照組比較，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01，﹡﹡﹡P<0.001； B. 第4天時(shí)細(xì)胞結(jié)晶紫染色，標(biāo)尺=1000 μm。Fig.2 TP53 gene knockout promoted cell proliferationNote:A. cell proliferation curve；Con，control group；KO，TP53 gene knockout group；compared with control group，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01，﹡﹡﹡P<0.001； B. crystal violet staining at the fourth day，bar=1000 μm

2.4 TP53基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂

TP53基因敲除組處于G1期的細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P=0.0015)，而處于S期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P=0.02)；G2期細(xì)胞比例兩組間沒有明顯差異(P=0.8)，圖3所示。表明TP53基因敲除加速細(xì)胞DNA合成，并促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期分化。

圖3 TP53基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂注：Con，對(duì)照組；KO，TP53基因敲除組；﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01Fig.3 TP53 gene knockout led to cell cycle disordersNote;Con,control group；KO，TP53 gene knockout group；﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01

2.5 TP53基因敲除促進(jìn)細(xì)胞克隆形成

小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞TP53基因敲除后細(xì)胞克隆形成能力顯著高于對(duì)照組(P=0.01)，圖4A。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)14 d后，TP53基因敲除組細(xì)胞集落數(shù)量和直徑均明顯大于對(duì)照組(圖4B)。軟瓊脂細(xì)胞集落形成顯示，TP53基因敲除組細(xì)胞集落數(shù)量顯著多于對(duì)照組(P=0.0002)，圖4C；但細(xì)胞集落形成率太低，直徑較小(圖4D)，表明TP53基因敲除不能夠?qū)е旅黠@的細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)化。

圖4 TP53基因敲除促進(jìn)細(xì)胞克隆形成注：A，單層培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成，Con，對(duì)照組；KO，TP53基因敲除組,﹡﹡P<0.01；B，3個(gè)重復(fù)孔中代表性1孔，6孔板；C，軟瓊脂細(xì)胞集落形成，﹡﹡﹡P<0.001；D，細(xì)胞集落光鏡照片，標(biāo)尺=1000 μmFig.4 TP53 knockout promoted cell clone formationNote:A. Clone formation of monolayer culture cells；Con，control group, KO，TP53 gene knockout group,﹡﹡P<0.01；B，Representative of triplication well, 6 well plate; C，soft agar colony formation，﹡﹡﹡P<0.001；D，Cell colony picture，bar=1000 μm

圖5 TP53基因敲除促進(jìn)細(xì)胞遷移侵襲注：A，遷移細(xì)胞統(tǒng)計(jì)，Con，對(duì)照組；KO，TP53基因敲除組；﹡﹡﹡P<0.001；B，3個(gè)重復(fù)遷移孔中代表性視野,×100；C，侵襲細(xì)胞統(tǒng)計(jì)，﹡﹡﹡P<0.001；D，3個(gè)重復(fù)侵襲孔中代表性視野×100Fig.5 TP53 gen knockout promoted cell migration and invasionNote：A，Cell migration analysis，Con，control group；KO，TP53 gene knockout group；﹡﹡﹡P<0.001；B，Representative field of triplicationmigration well,×100；C，Cell invasion analysis，﹡﹡﹡P<0.001；D，Representative field of triplication invasion well×100

2.6 TP53基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞遷移侵襲增強(qiáng)

TP53基因敲除組細(xì)胞遷移能力顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P=0.0032，圖5A)，穿過細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組(圖5 B)。侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組沒有細(xì)胞穿過膠基質(zhì)以及transwell上室小孔(圖5D)，而TP53基因敲除組細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)(圖5C)。

3 討論

TP53為含鋅轉(zhuǎn)錄因子，通過直接作用或間接調(diào)節(jié)其下游基因的表達(dá)，在DNA修復(fù)、細(xì)胞周期捕獲、細(xì)胞凋亡、分化等過程中起重要作用。該基因突變與功能喪失是卵巢癌中最常見的基因異常之一[10]。基因編輯是研究細(xì)胞基因功能及其分子機(jī)制的必要手段，本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速、經(jīng)濟(jì)、有效地構(gòu)建了TP53基因敲除小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞系。LentiCRISPRv2為Zhang lab第二代CRISPR/Cas9慢病毒載體，Cas9的特異性靶點(diǎn)依賴于原型間隔序列3′端PAM序列，不同的Cas9突變體在基因組中擁有不同的PAM序列，來源于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9識(shí)別5′- NGG-3′的PAM[11]，在人類基因組中約每8 bp就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)，幾乎所有基因都能進(jìn)行定點(diǎn)修飾。

TP53基因敲除引起小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞功能改變，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、克隆形成以及遷移侵襲能力。TP53基因敲除細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致其調(diào)節(jié)功能喪失，細(xì)胞增殖旺盛。細(xì)胞周期分析表明TP53基因敲除引起細(xì)胞DNA合成加速，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期分化。p53蛋白通過反式激活基因如p21(CDK-抑制劑1)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，p21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶。金鎮(zhèn)等[12]研究說明在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中過表達(dá)TP53基因后，腫瘤細(xì)胞G1/G0期比例增加，而S期和G2/M期的比例下降，表明TP53基因過表達(dá)使卵巢癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，該基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起重要作用。TP53基因敲除使原代細(xì)胞克隆形成能力顯著增強(qiáng)，但軟瓊脂中細(xì)胞集落形成率較低，而且直徑較小，表明細(xì)胞尚不具備形成腫瘤的特點(diǎn)。Orsulic等[13]使用禽逆轉(zhuǎn)錄病毒受體(TVA)系統(tǒng)將多個(gè)癌基因轉(zhuǎn)入小鼠卵巢上皮細(xì)胞建立了基因修飾小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，TP53基因缺陷小鼠卵巢細(xì)胞可以通過至少2個(gè)癌基因(c-Myc、K-ras、Akt)組合發(fā)生轉(zhuǎn)化，而僅TP53基因缺陷不能使細(xì)胞發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化。TP53基因敲除導(dǎo)致小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)p53能夠促進(jìn)MDM2介導(dǎo)的Slug的降解而增強(qiáng)E-cadherin的表達(dá)[14]。E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，其功能喪失引起細(xì)胞間粘附作用破壞，是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型的重要因素[15]。在很多p53缺失的腫瘤中發(fā)現(xiàn)Slug表達(dá)升高，并且伴隨E-cadherin表達(dá)喪失[16]。

上述結(jié)果表明，利用CRISPR/Cas9成功構(gòu)建了TP53基因敲除小鼠原代卵巢上皮細(xì)胞系。該方法對(duì)研究基因功能有重要意義。TP53基因作為重要的抑癌基因，其功能喪失導(dǎo)致小鼠原代上皮細(xì)胞增殖速度加快，細(xì)胞周期紊亂，克隆形成以及遷移侵襲能力增強(qiáng)。該細(xì)胞模型是研究卵巢腫瘤發(fā)生機(jī)制以及基因之間關(guān)系的重要工具。