曾海娟， 謝曼曼， 丁承超， 劉武康， 董慶利， 劉 箐

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是革蘭染色陽性的一種重要的食源性致病菌，廣泛分布于土壤、污水等環(huán)境中[1]。Lm具有較強的生存能力，pH在4.5～9.0，溫度在0～45 ℃均可增殖[2]，在冰淇淋、原奶、生肉、干酪、海鮮及方便食品，如熟肉、熏魚中均有檢出[3-6]。由于食用了被污染的食物導(dǎo)致單增李斯特菌的感染[7]，患者死亡率可達(dá)30%以上。單增李斯特菌是典型的細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可通過李斯特菌溶血素等的裂解作用下逃離吞噬小體[8-9]，進入并在細(xì)胞質(zhì)中增殖，在其中產(chǎn)生的蛋白將激活CD8+T細(xì)胞，部分被吞噬溶酶體直接殺死，降解的蛋白呈遞給CD4+T細(xì)胞。Lm引起的獨有的這種功能免疫應(yīng)答機制，使得減毒李斯特菌成為一種潛在的可攜帶腫瘤、病毒及細(xì)菌抗原的疫苗載體[10]。 基因dat(daaA)存在于多種細(xì)菌中，其編碼D-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用可將D-谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-丙氨酸(D-Ala)，后者為細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的重要組成成分[11]。在單核細(xì)胞增生性李斯特菌中，存在兩種途徑生成D-Ala：基因dal編碼丙氨酸消旋酶(Alr)，可將L-Ala轉(zhuǎn)化為D-Ala；基因dat編碼D-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白，可將D-谷氨酸與丙酮酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成D-Ala與α-酮戊二酸，當(dāng)dat與dat基因全部缺失時，由于不能產(chǎn)生D-Ala，在無外源D-Ala添加時，該dat/dat雙基因缺失菌株將發(fā)生溶菌死亡[14]。當(dāng)菌株缺失dat基因時，該缺失菌株在生長狀態(tài)、毒力基因表達(dá)水平、細(xì)胞侵襲性、生物被膜的生成量等方面的影響目前尚無研究報道。 作為一種潛在的疫苗載體，對李斯特菌進行減毒以保證安全性就顯得尤為重要。本研究以單增李斯特菌野生株EGDeactA及inlB雙基因缺失株(EGDe ΔactAΔinlB)為材料，利用同源重組的方法構(gòu)建缺失了dat基因的菌株(EGDeΔactAΔinlBΔdat)，并對構(gòu)建的該缺失菌株的生長狀態(tài)、毒力基因表達(dá)水平、細(xì)胞侵襲性及生物被膜的生成量等方面做進一步分析。該項研究對菌株EGDeΔactAΔinlBΔdat的特性提供了參考，為研究dat基因的功能提供了材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 單增李斯特菌野生株EGDe、穿梭質(zhì)粒pKSV7由上海交通大學(xué)史賢明教授贈予，EGDeΔactAΔinlB由本實驗室構(gòu)建，大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；PCR相關(guān)試劑、RT-PCR相關(guān)試劑、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶，TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)，北京陸橋技術(shù)有限公司；氨芐青霉素、氯霉素及其他常規(guī)試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；PCR熱循環(huán)儀、熒光實時定量PCR儀，Applied Biosystems公司；凝膠成像儀、Thermo濃度測定儀，美國Thermo基因有限公司；Mini-power電泳儀、電穿孔儀，美國伯樂公司；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀，美國分子儀器公司。

1.1.3 引物 根據(jù)GenBank登錄的基因序列(登錄號Gene ID：985722NC_003210.1)，用Primer3 Input設(shè)計擴增上游同源臂引物P1/P2，下游同源臂引物P3/P4。連接后PCR引物為P1/P4，全長1 980 bp，缺失片段大小為839 bp。相關(guān)引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR擴增所用的引物序列

1.2 方法

1.2.1 基因缺失株的構(gòu)建 ①穿梭重組質(zhì)粒的構(gòu)建：引物P1/P2及P3/P4分別用于擴增dat基因的上下游同源臂，擴增片段分別經(jīng)BamH I 單酶切后16 ℃過夜連接約16 h，以引物P1/P4對連接產(chǎn)物進行擴增，后經(jīng)DNA回收試劑盒割膠純化回收，再經(jīng)SalI與SmaI 酶切。酶切片段經(jīng)瓊脂糖電泳后割膠純化回收，與經(jīng)SalI與SmaI酶切的穿梭質(zhì)粒pKSV7連接，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α中，涂布含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。②電轉(zhuǎn)化與同源重組：引物P1/P4對LB平板上的單菌落進行PCR鑒定。鑒定為陽性的克隆抽提質(zhì)粒后送華大基因測序。測序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)12.5 kV/cm、3 ms電轉(zhuǎn)化至EGDe ΔactAΔinlB中，涂布含氯霉素(10 μg/mL)的抗性平板培養(yǎng)24～48 h，引物P1/P4對平板上的單菌落進行鑒定。鑒定為陽性的克隆在41 ℃和氯霉素雙重壓力下傳8代，然后在30 ℃無抗性條件下傳6代，末代培養(yǎng)物在無抗性BHI平板上劃線。③缺失株的鑒定：挑取BHI平板上的單菌落于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別用引物P1/P4及tF/tR進行PCR鑒定，鑒定成功的菌株分別劃線于BHI平板及含氯霉素(10 μg/mL)抗性平板，37 ℃培養(yǎng)。

1.2.2 缺失株生長曲線測定 利用酶標(biāo)儀對EGDe ΔactAΔinlB及EGDeΔactAΔinlBΔdat的生長能力進行測定。挑取BHI平板上的單菌落37 ℃過夜培養(yǎng)后，按1∶100轉(zhuǎn)接到新鮮的液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)。每間隔1 h吸取樣品于96孔微孔板中，酶標(biāo)儀測定600 nm處的吸光度光密度值(OD值)后繼續(xù)37 ℃搖床培養(yǎng)，連續(xù)測12 h。

1.2.3 毒力基因表達(dá)水平的檢測(RT-PCR) 為確定該基因?qū)ζ渌玖蚣癲al表達(dá)量的影響，本實驗比較了兩株菌在多個基因表達(dá)量上存在的差異。分別挑取EGDeΔactAΔinlB及EGDe ΔactAΔinlBΔdat平板上的單菌落過夜培養(yǎng)后，各取5 mL飽和菌液提取RNA后，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明先去除其中的DNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR，實驗中所用的其他毒力基因引物見表2。

表2 qRT-PCR所用的引物序列

1.2.4 生物被膜的形成量 構(gòu)成生物被膜的胞外多糖可與結(jié)晶紫結(jié)合，可利用胞外多糖的量來衡量生物被膜的生成量。將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌用新鮮的BHI液體培養(yǎng)基調(diào)整至OD600為0.15，取200 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)48 h。無菌PBS洗3遍后，1%的結(jié)晶紫染色30 min，無菌水洗3遍，每孔滴加95%乙醇洗脫30 min，利用酶標(biāo)儀測量其在570 nm下的吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實驗 將生長良好的Caco-2細(xì)胞消化并轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)。細(xì)菌侵襲前，以感染復(fù)數(shù)MOI=100∶1的比例加入新鮮的待測菌液共培養(yǎng)2 h。侵襲結(jié)束后，換用慶大霉素(200 μg/mL)37 ℃處理30 min。將慶大霉素吸出，無菌生理鹽水輕柔清洗2次，1% Triton X-100裂解細(xì)胞，每孔充分吹打并收集至離心管中，生理鹽水梯度稀釋涂布BHI平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)并計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 上下游片段擴增及連接

上下游同源臂片段經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電

泳，條帶大小分別在980 bp和1 000 bp左右(圖1a)，連接后產(chǎn)物經(jīng)電泳，顯示一條約1 980 bp的條帶(圖1b)，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 上下游同源臂及連接后PCR擴增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification results of upstream and downstream homologous arm and after connecting a1：上游同源臂；a2：下游同源臂;b：上下游連接后擴增片段;M1：DL 1 000 bp marker；M2：DL 2 000 bp markera1: Upstream homologous arm; a2: Downstream homologous arm; b: Amplified fragment after upstream and downstream homologous arm connecting; M1: DL 1 000 bp marker; M2: DL 2 000 bp marker

2.2 穿梭重組載體構(gòu)建

連接片段經(jīng)SalI及SmaI酶切后，與同樣經(jīng)酶切的穿梭質(zhì)粒pKSV7連接，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α中。陽性克隆抽提重組質(zhì)粒測序成功后，經(jīng)雙酶切鑒定，可見1 980 bp左右的片段，大小與預(yù)期一致(圖2a)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化鑒定結(jié)果如圖2b，可見1 980 bp左右的條帶(泳道3、4)，表明重組質(zhì)粒成功電轉(zhuǎn)化至EGDeΔactAΔinlB中。

圖2 鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results a：雙酶切鑒定結(jié)果； b：電轉(zhuǎn)化鑒定結(jié)果； M1：DL 10 000；M2：500 bp marker；b1～b4：單菌落a: Identification of double digestion; b: Identification of electrotransformation； M1: DL 10 000 bp marker; M2: 500 bp marker; b1-b4: Monoclonal strains

2.3 缺失株的鑒定

引物tF/tR的結(jié)合位點位于缺失的839 bp的序列上，若dat基因被敲除，則該引物將不能擴增出條帶。鑒定時，分別采用引物P1/P4及tF/tR對單菌落PCR擴增，若P1/P4擴增出1 980 bp左右的條帶，而tF/tR未擴增出條帶，則該菌株為疑似敲除菌株。如圖3a(1～2)所示，引物P1/P4擴增出1 980 bp左右的條帶；如圖3b(1～2)所示，引物tF/tR未擴增出條帶，表明1、2號為疑似敲除株，經(jīng)氯霉素抗性進一步鑒定，該克隆不能在抗性平板上生長，確定為敲除株。

圖3 基因缺失株的鑒定Fig.3 Identification of gene deletion stain a：引物P1/P4擴增產(chǎn)物； b：引物tF/tR擴增產(chǎn)物； 1～2：單克隆菌株；3：陰性對照；4：陽性對照； M1：500 bp marker；M2：DL 1 000 markera: PCR products of P1/P4 primers； b: PCR products of dat-F/dat-R primers 1-2: monoclonal strains; 3: Negative control; 4: Positive control; M1: 500 bp marker; M2: DL 1 000 marker

2.4 生長曲線測定

酶標(biāo)儀測定12個時間點的600 nm處的光密度值繪制生長曲線，如圖4所示，與親本株EGDeΔactAΔinlB相比，敲除株EGDeΔactAΔinlBΔdat培養(yǎng)5～8 h的菌濃度低于親本株(P<0.01)，而在10 h后達(dá)到的菌濃度與親本株相同。表明dat基因的缺失使菌株通過另一途徑經(jīng)丙氨酸消旋酶作用產(chǎn)生D-Ala，但在菌株快速增長的對數(shù)期，單一基因產(chǎn)生的D-ala不足以維持菌株生長需要，因而對數(shù)期菌濃度低于親本株。

圖4 生長曲線Fig.4 Growth curve **：差異顯著(P<0.01)；***：差異顯著(P<0.001)，下圖同 **: Significant difference (P<0.01); ***: Significant difference (P<0.001)，same the follow

2.5 毒力基因的相對表達(dá)量

本實驗選取了李斯特菌EGDe的12個毒力基因及與D-Ala合成有關(guān)的2個基因，比較EGDe ΔactAΔinlB與EGDe ΔactAΔinlBΔdat在基因表達(dá)量上存在的差異，其中以EGDe ΔactAΔinlB的基因表達(dá)水平為對照組，即EGDeΔactAΔinlB的每個目的基因表達(dá)水平均以1表示，EGDe ΔactAΔinlBΔdat的目的基因表達(dá)水平大于1為表達(dá)上調(diào)，反之則為表達(dá)下調(diào)。由圖5，可知菌株EGDe ΔactAΔinlBΔdat的dat基因無信號，進一步驗證dat基因的缺失；EGDe ΔactAΔinlBΔdat與EGDeΔactAΔinlB相比，基因srtA、plcA表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)，VIP、inlA基因表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。

圖5 qRT-PCR結(jié)果Fig.5 Results of qRT-PCR

2.6 生物被膜的生成量

生物被膜是細(xì)菌抵抗外界不利環(huán)境時形成的，它是一種多細(xì)胞聚合物，由細(xì)菌團塊與表多糖、蛋白和胞外DNA構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)形成的復(fù)合物。由圖6可知，與親本株EGDe ΔactAΔinlB相比，dat基因的缺失使得菌株形成生物被膜的能力顯著增加(P<0.01)，而在培養(yǎng)基中添加D-Ala的缺失株菌膜生成量與EGDe ΔactAΔinlB相比無顯著差異，推測由于dat基因的缺失使菌株處于D-Ala營養(yǎng)不足的脅迫狀態(tài)，因而對于外界不利條件形成自我保護的生物被膜。

圖6 生物被膜生成量比較Fig.6 Comparation of biofilm

2.7 細(xì)胞侵襲結(jié)果

由Caco-2細(xì)胞侵襲結(jié)果(圖7)可知，敲除actA及inlB基因后，菌株EGDe ΔactAΔinlB的侵襲能力顯著下降(P<0.05)，表明actA及inlB基因在細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮了重要作用。缺失dat基因，并未對侵襲結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，表明dat基因敲除后，菌株的侵襲能力并無發(fā)生變化，也不會引起菌株毒力返祖的現(xiàn)象。

圖7 細(xì)胞侵襲結(jié)果Fig.7 Results of cell infection *：差異顯著(P<0.05) *: Significant difference (P<0.05)

3 討 論

作為一種胞內(nèi)寄生的模式菌，闡明 Lm 致病的分子機制對于研制具有應(yīng)用前景的弱毒疫苗和活疫苗載體具有十分重要的意義。相關(guān)報道表明，單增李斯特菌識別、黏附與侵入宿主細(xì)胞的過程與內(nèi)化素基因(inl)編碼的內(nèi)化素A和B有關(guān)[18-19]，而其在細(xì)胞間運動及擴散由毒力基因plcA、plcB、hly、actA等介導(dǎo)[20-22]。根據(jù)文獻(xiàn)，單增李斯特菌dal/dat雙基因缺失株的毒力將明顯減弱，與野生株相比，對小鼠的半數(shù)致死率可提高4個數(shù)量級[23]。本研究在單增李斯特菌actA及inlB雙基因缺失株的基礎(chǔ)上，利用同源重組成功構(gòu)建了dat基因缺失的三基因缺失株，并對該缺失菌株的生長特性狀態(tài)、毒力基因表達(dá)的變化、生物被膜的生成量及對細(xì)胞的侵襲性進行了研究。結(jié)果顯示，缺失dat基因的菌株在無外源D-Ala補充時雖能生存，但缺失株對數(shù)期的菌濃度顯著低于EGDe ΔactAΔinlB(P<0.01)，可能由于dal基因產(chǎn)生的D-丙氨酸的量不足以維持菌株快速生長的需要，因而對數(shù)期的菌濃度低于親本株。RT-PCR結(jié)果顯示，與親本株EGDe ΔactAΔinlB相比，基因srtA、plcA表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)，VIP、inlA基因表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。缺失株菌膜生成量顯著增加(P<0.01)，培養(yǎng)基中添加D-Ala后菌膜生成量與親本株相比無差異，表明基因dat缺失使菌株處于一種外界營養(yǎng)脅迫狀態(tài)。缺失株對Caco-2細(xì)胞的侵襲與親本株相比無顯著差異。本研究表明基因dat在菌株生長及菌膜生成上起重要的調(diào)控作用，但不會影響菌株毒力。

在革蘭陽性菌，如鼠傷寒及豬霍亂沙門氏菌中[24]，同樣存在類似功能的基因—asd基因，編碼天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶。asd缺失菌株在無外源二氨基庚二酸存在的條件下會發(fā)生溶菌死亡，通過質(zhì)?；匮aasd基因并攜帶外源抗原基因而表達(dá)相應(yīng)抗原蛋白，能有效解決質(zhì)粒攜帶外源基因表達(dá)不穩(wěn)定的問題，為沙門氏菌活疫苗載體的研發(fā)開辟了新的途徑。由于單增李斯特菌中存在兩個功能類似的基因dal與dat，而由本研究表明，單獨缺失dat基因并不能構(gòu)建李斯特菌的營養(yǎng)缺陷體，的因而下一步計劃是在本研究的基礎(chǔ)上進一步缺失dal基因，通過質(zhì)?；匮adal或dat基因并攜帶外源抗原基因，構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)外源基因的單增李斯特菌活疫苗載體。該項研究通過對缺失株生長特性、基因的相對表達(dá)量、生物被膜的生成量及對細(xì)胞的侵襲性的研究，為基因dat缺失后菌株的生物學(xué)特性提供依據(jù)，并對進一步缺失dal基因，構(gòu)建李斯特菌活疫苗載體提供參考。