王荻瀟， 鐘 敏， 雷曉凌， 聶芳紅， 鄧義佳， 姚遠(yuǎn)蓓

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ,廣東 湛江 524088)

珊瑚作為一類無脊椎動(dòng)物存在于海洋環(huán)境中，種類繁多，被稱為海洋的“熱帶雨林”。珊瑚與周圍水環(huán)境及其附生的藻類、微生物群體形成穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，與其共附生微生物協(xié)同進(jìn)化，形成了良好的互惠關(guān)系[1-2]。微生物作為珊瑚生態(tài)系統(tǒng)中重要組成部分，對(duì)維持該生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著及其重要的作用[3-4]。有研究表明珊瑚共附生微生物可為其化學(xué)防御提供武器[5]，對(duì)抵御外來物種侵害以及環(huán)境變化方面具有重要意義。 海洋微生物資源與陸地資源相比較豐富，研究潛力大但開發(fā)率低[6]。海洋真菌作為海洋共附生微生物重要的組成部分，已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前有關(guān)海洋真菌的研究主要集中于抗菌、抗腫瘤等活性物質(zhì)的開發(fā)[7-9]，如Li等[10]從中國(guó)三亞國(guó)家珊瑚礁保護(hù)區(qū)的珊瑚Sarcophytontortuosum中分離出1株真菌Chondrostereumsp.，能產(chǎn)生一種對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的倍半萜類化合物，但對(duì)海洋真菌的鑒定及生理學(xué)特性報(bào)道較少，目前研究較多的珊瑚共附生真菌主要有子囊菌和半知菌[11-12]。除常見種屬外，還發(fā)現(xiàn)一些較罕見菌，如Koh等[13]從新加坡地區(qū)柳珊瑚分離出粘鞭霉Gliomastixsp.和齒梗孢Scolecobasidiumsp.。Wangt等[14]從中國(guó)南海海域柳珊瑚上分離得到鏈格孢Alternariasp.、黑孢霉Nigrosporasp.及叢赤殼Nectriasp.，但均未對(duì)其進(jìn)行生理學(xué)特性研究。雖然罕見菌的分離豐富了海洋真菌基因和形態(tài)多樣性，但對(duì)生理特性研究的缺乏嚴(yán)重阻礙對(duì)其活性物質(zhì)的進(jìn)一步開發(fā)。因此，對(duì)罕見菌種生理學(xué)特性的研究，可為后期活性物質(zhì)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。本課題組通過對(duì)叢生盔形珊瑚中分離的菌株XWC14-13進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征、rDNA ITS基因序列分析鑒定，并研究不同溫度、pH和鹽度對(duì)該菌株生長(zhǎng)的影響，篩選出最優(yōu)培養(yǎng)條件，為進(jìn)一步研究該珊瑚真菌潛在的生物活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 本研究所用菌株XWC14-13分離自湛江市徐聞縣叢生盔形珊瑚，現(xiàn)保存于廣東省微生物菌種保藏中心，編號(hào)為GDMCC 60006。

1.1.2 培養(yǎng)基 查氏瓊脂培養(yǎng)基(CA)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。以上培養(yǎng)基均采用人工海水進(jìn)行配制，海水配比為3%[15]。

1.1.3 試劑和儀器 SK8259試劑盒(真菌基因組DNA抽提試劑盒)、dNTP、DNA Ladder Mix maker、引物，購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；Taq-Tm DNA聚合酶，購(gòu)自北京金石百優(yōu)科技有限公司(MBI品牌)；瓊脂糖，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司(BBI品牌)。DYCP-31DN DNA電泳槽(北京六一儀器廠)；FR980凝膠成像儀(上海復(fù)日科技儀器有限公司)；2720 thermal cycler PCR儀(Applied Biosystems)；HC-2518R冷凍高速離心機(jī)(BBI)；DM4B數(shù)字顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 ①菌落觀察：采用點(diǎn)植法將菌株接種于CA和PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)6 d，觀察菌落大小、形態(tài)和色澤等，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。②個(gè)體形態(tài)觀察：選取適宜培養(yǎng)基，對(duì)菌株進(jìn)行插片法培養(yǎng)[16]，每隔12 h進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.2.2 分子學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 ①分子學(xué)鑒定：將菌株XWC14-13在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d，取50 mg新鮮菌體，采用SK8259試劑盒提取DNA。PCR擴(kuò)增引物為ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4: 5′-TCCTC-CGCTTATTGATATGC-3′。25 μL反應(yīng)體系：模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，酶0.2 μL，正向引物和反向引物均為0.5 μL，ddH2O 19.8 μL。PCR循環(huán)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，由生工(上海)生物工程股份有限公司完成。②系統(tǒng)發(fā)育樹的建立：將測(cè)得的ITS序列上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)菌株登錄號(hào)在NCBI網(wǎng)站通過對(duì)比引擎BLAST進(jìn)行在線對(duì)比分析，獲取親源關(guān)系較近菌株的基因序列，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定菌株的親緣關(guān)系。

1.2.3 菌株XWC14-13生理學(xué)特性研究 ①溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：采用點(diǎn)植法將菌株接種在PDA培養(yǎng)基中心上，分別置于0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃ 10個(gè)溫度梯度下培養(yǎng)5 d，每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑，試驗(yàn)設(shè)3組平行。②酸堿度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：將PDA的pH值分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、10.0、11.0、12.0，采用直徑7.2 mm無菌打孔器將菌餅接種到平板中心，28 ℃培養(yǎng)5 d，每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑，試驗(yàn)設(shè)3組平行。③鹽濃度(體積分?jǐn)?shù))對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：用海水晶將PDA的鹽濃度分別配制成0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、10%、15%、20%，采用點(diǎn)植法接種，28 ℃培養(yǎng)5 d，每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑，試驗(yàn)設(shè)3組平行。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XWC14-13在CA和PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況及形態(tài)鑒定

菌株XWC14-13在CA和PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后均能顯著生長(zhǎng)，且在6 d內(nèi)均能長(zhǎng)成明顯菌落。但在6 d內(nèi)，PDA培養(yǎng)基上的菌落直徑顯著大于CA培養(yǎng)基(P<0.05)。在第1天時(shí)CA培養(yǎng)基的菌株直徑為(2.81±0.65) mm，顯著低于在PDA上生長(zhǎng)的菌落直徑(P<0.05)。第6天在CA上的菌株大小僅為在PDA上菌株大小的41%，表明PDA比CA更適宜此菌株生長(zhǎng)(表1)。

表1 菌株XWC14-13在CA和PDA培養(yǎng)基上不同培養(yǎng)時(shí)間的菌落直徑(N=3,mm)

注：同一列平均數(shù)中標(biāo)有不同字母，表示在0.05水平上差異顯著,下表同

菌株XWC14-13在CA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，第6天觀察菌落正面為白色、中心緊實(shí)，四周質(zhì)地呈薄而半透明狀，絨毛疏松，反面無褶皺，且正、反兩面無明顯差異。菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，菌落大且厚實(shí)、生長(zhǎng)初期呈白色，第6天呈乳白色。正面平展，毛氈狀，邊緣較稀疏，菌落反面呈淡黃色，有向心褶皺及半透明螺紋(圖1)。

圖1 菌株XWC14-13在CA和PDA上培養(yǎng)第6天的菌落特征Fig.1 Morphological characteristics of strain XWC14-13 developed on CA and PDA at 6th day A、B分別為菌株XWC14-13在CA和PDA培養(yǎng)基上的菌落正面特征；a、b分別為菌株XWC14-13在CA和PDA培養(yǎng)基上的菌落反面特征 A，B: Surface colony of XWC14-13 grew in CA and PDA； a，b: Back colony of XWC14-13 grew in CA and PDA

在PDA上培養(yǎng)24 h，菌株XWC14-13菌絲呈半透明狀，產(chǎn)生少量小而光滑、透明圓形孢子囊；36 h孢子囊數(shù)量增多，部分從半透明變?yōu)楹稚斏?、?cè)生或著生于短的突起，或生于長(zhǎng)柄或側(cè)分枝上；48 h菌絲變粗糙，并產(chǎn)生少量半透明膈膜；60～72 h，孢子囊數(shù)量增多，變大且呈深褐色，呈現(xiàn)出圓形、卵圓形、燒瓶狀，部分成熟脫落，此時(shí)囊托基本形成，膈膜顏色變深；84 h時(shí)，部分孢子囊破裂，釋放大量孢子，孢囊孢子表面光滑，呈短小、細(xì)長(zhǎng)、透明狀，囊托形態(tài)明顯(圖2)。

圖2 菌株XWC14-13在PDA上的形態(tài)特征(28 ℃)Fig.2 Microstructure character of strain XWC14-13 on PDAA：幼齡菌絲(24 h)；B：孢子囊(36 h)；C：膈膜(48 h)；D：孢囊孢子(84 h)；E:孢子囊(72 h)；F：孢子囊(84 h)；G：對(duì)比菌株Gongronella butleri(KP055605)生長(zhǎng)后期, 箭頭指向橫隔A: Young hyphae(24 h); B: Sporangium(36 h); C:Septate(48 h); D: Sporangiospore(84 h); E: Sporangium(72 h)；F: Sporangium(84 h); G: The late growth stage of compared strain of KP055605, arrows to septate

整個(gè)生長(zhǎng)過程中，菌株XWC14-13菌絲大小為3.62～8.09 μm，孢囊梗大小為4.88～6.76 μm，囊托大小為5.13～9.56 μm，孢子囊大小為(5.15～7.57) μm×(23.53～25.74) μm，孢囊孢子大小為(2.02～3.03)μm×(2.01～1.52)μm。菌株XWC14-13與Babu等[17]報(bào)道的菌株Gongronellabutleri(KP055605)形態(tài)大體相似，均有膈膜與孢子囊，但與對(duì)比菌株相比孢子囊較大，孢子較小，不產(chǎn)厚垣孢子。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將所得ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，菌株XWC14-13(KX911872)與球托霉屬(Gongronellasp.)同源性最高，從GenBank中找出與XWC14-13同源性較高的7株菌株的基因序列，用MEGA6.0軟件，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，從圖3可以看出，菌株XWC14-13與菌株Gongronellabutleri(KP055605)聚為一支，結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果，將菌株XWC14-13鑒定為Gongronellabutleri。

圖3 基于ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 溫度對(duì)菌株XWC14-13生長(zhǎng)的影響

菌株XWC14-13在15～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度差異較顯著(P<0.05)(表2)。在30 ℃條件下生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑最大；在15 ℃條件下生長(zhǎng)速度極其緩慢，培養(yǎng)至第4天才有生長(zhǎng)跡象；在35 ℃仍具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，但在40 ℃不生長(zhǎng)(表2)。菌落最適宜生長(zhǎng)溫度依次為30、35、25、20、15 ℃。

表2 不同溫度對(duì)菌株XWC14-13菌絲生長(zhǎng)的影響

注：“-”代表不生長(zhǎng)，下表同

2.4 酸堿度對(duì)菌株XWC14-13生長(zhǎng)的影響

菌株XWC14-13在pH 3.0～11.0之間均能生長(zhǎng)，pH為2.0和12.0不生長(zhǎng)。pH為3.0時(shí)PDA培養(yǎng)基呈液狀，菌株可呈膜塊狀生長(zhǎng)；pH為4.0～11.0條件下，菌株培養(yǎng)5 d內(nèi)生長(zhǎng)直徑變化顯著(P<0.05)。培養(yǎng)初期生長(zhǎng)直徑范圍為8.90～10.52 mm，5 d時(shí)菌株直徑均達(dá)到40 mm且最大值為45.84 mm(pH=8.5)(表3)。

表3 不同pH對(duì)菌株XWC14-13生長(zhǎng)的影響

注：“+”代表液體生長(zhǎng)

圖4 菌株XWC14-13在不同pH時(shí)第4天與第5天生長(zhǎng)比較Fig.4 Growth comparison of strain XWC14-13 in different pH on day 4th and 5th

從圖4可看出，第4天時(shí)，菌株生長(zhǎng)直徑較大的pH范圍為7.5～8.5，第5天的最適pH為8.0～10.0，綜合分析可篩選出菌株最適宜生長(zhǎng)的pH范圍為8.0～8.5。

2.5 鹽濃度對(duì)菌株XWC14-13生長(zhǎng)的影響

菌株XWC14-13在鹽濃度為0～10%(體積分?jǐn)?shù))范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，15%不生長(zhǎng)(表4)。在鹽度為1%時(shí)生長(zhǎng)最好，鹽質(zhì)量濃度為2%～4%生長(zhǎng)較好，第5天的菌落直徑均達(dá)到30 mm以上。隨鹽質(zhì)量濃度增加，生長(zhǎng)速率逐漸降低，鹽質(zhì)量濃度為10%時(shí)生長(zhǎng)顯著減緩(P<0.05)(表4)。在無鹽環(huán)境下，菌株仍能生長(zhǎng)，但速率較低。

表4 不同鹽度對(duì)菌株XWC14-13菌絲生長(zhǎng)的影響

3 討 論

本研究對(duì)珊瑚共附生真菌中分離的菌株XWC14-13進(jìn)行形態(tài)學(xué)和ITS1-ITS4分子鑒定，表明該菌株與報(bào)道菌株Gongronellabutleri(KP055605)[17]極為相似，因此鑒定菌株XWC14-13為卵形球托霉Gongronellabutleri，但該菌未產(chǎn)厚垣孢子，且孢囊孢子顯著小于對(duì)比菌株。生理學(xué)特性研究結(jié)果表明，菌株XWC14-13在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，最適溫度為30 ℃，pH為8.0～8.5，鹽度1%，但其在pH 3.0～11.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)良好，具有廣泛的酸堿耐受性。 Nguyen等[18]研究的1株來自森林土壤的Gongronellasp.在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，李桂舫等[19]研究了分離自黃海和渤海海域漂流木上的4株海生毛殼菌，與菌株XWC14-13均具有相似特征，海水偏堿性且具有一定鹽度，此菌株最適生長(zhǎng)條件偏堿性，并有耐鹽能力，因此可初步判斷其符合海洋真菌的生理特性。巴斯洛[20]在1985年提出兼性海洋微生物的概念。Sakayaroj等[21]表明植物內(nèi)生真菌同樣存在于海洋，并具有在海洋環(huán)境中生長(zhǎng)和繁殖的能力。目前已有大量研究表明兼性物種在基因組成、生態(tài)功能及生理活性方面具有多樣性[22-24]。王軍等[25]從南海紅樹內(nèi)生真菌中分離出的異香豆素 avicennin-A，是一種陸生真菌代謝產(chǎn)物中未見報(bào)道的化合物。與本研究菌株相似的球托霉菌屬多從土壤中分離[26-28]，目前并未在其他環(huán)境中發(fā)現(xiàn)。菌株XWC14-13分離自海洋環(huán)境，最適宜生長(zhǎng)條件與海洋環(huán)境條件相符，具有一定的耐鹽性，但在無鹽環(huán)境下也可生長(zhǎng)，屬于兼性海洋微生物，比在土壤中分離得到的同種菌具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性與抗逆性，具有更大的開發(fā)潛力。目前本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)菌株XWC14-13具有一定的抗菌活性，其他性質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于Gongronellabutleri的應(yīng)用研究較少，主要通過酶解細(xì)胞壁或紫外誘變方法制備高純度殼聚糖和殼聚糖-葡聚糖復(fù)合物[29-30]。殼聚糖和葡聚糖作為重要的真菌骨骼多糖，主要存在于接合菌綱的細(xì)胞壁中，對(duì)其結(jié)構(gòu)組成起到重要作用[31-32]。Nwe等[33]在強(qiáng)堿條件下，使用熱穩(wěn)定α-淀粉酶對(duì)生長(zhǎng)在紅薯片上的Gongronellabutleri菌株進(jìn)行酶解細(xì)胞壁(95 ℃、5 h)，獲得高純度的殼聚糖與殼聚糖-葡聚糖復(fù)合物，其穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[34-35]。