韓艷文，池 明，樊曉嵐，趙 航，閆師杰,3,*

（1.天津農(nóng)學院園藝園林學院，天津 300384；2.天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津 300384；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術工程中心，天津 300384）

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd. cv. Yali）是我國特有的古老品種，其產(chǎn)量大、品質(zhì)好、耐貯藏[1]。鴨梨采摘時間一般為每年的8月20日到9月底，采摘時間持續(xù)一個月之久，根據(jù)農(nóng)戶采摘經(jīng)驗，9月底采摘的鴨梨已經(jīng)過了最適采收期，稱其為晚采鴨梨。晚采鴨梨成熟度相對較高，果心更容易褐變[2]。目前鴨梨的貯藏方式為冷庫（0±1）℃貯藏，貯藏之前一般采用緩慢降溫的方式進行降溫，防止鴨梨冷害導致的果心褐變[3]。

目前關于鴨梨褐變的機理研究較多，有研究認為鴨梨果心褐變與鴨梨組織內(nèi)的多種酶類、酚類以及膜脂過氧化等因素有關[4]，苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonian-lyase，PAL）就是其中的一種酶。PAL是連接初級代謝和苯丙氨酸途徑的關鍵酶，是苯丙氨酸途徑的限速酶，也是催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應的酶[5-6]，對果實的生長、機械損傷愈合以及抗寒抗逆性等方面具有重要的作用[7]。目前已經(jīng)從新鮮蓮蓬[8]、鮮切馬鈴薯[9]、甜櫻桃[10]以及桃系新品‘保佳俊’[11]等的研究中得知PAL的活力與果實褐變的發(fā)生具有密切的聯(lián)系。PAL可以促進酚類物質(zhì)的合成與積累[12-14]，再通過多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用，發(fā)生酶促褐變，導致了果實褐變[15]。通過有效的手段減少酚類物質(zhì)的合成與積累，在一定程度上可以減少酚類物質(zhì)與過氧化物酶的反應，從而減少褐變的發(fā)生[16-18]。近幾年來，對于植物中PAL的研究多集中在基因克隆及表達特性方面，陳衛(wèi)衛(wèi)等[19]通過同源克隆得到了PpPAL基因的cDNA序列，并編碼蛋白質(zhì)，得知PpPAL是典型的PAL家族基因，對木質(zhì)素的合成起著重要的作用。孫潤澤等[20]對葡萄的PAL基因家族進行全基因組鑒定并做了表達分析，發(fā)現(xiàn)基因家族不同成員的作用不盡相同，其中VviPAL2和VviPAL15的表達與酚類物質(zhì)的積累密切相關。Irisarri等[21]采用cDNA末端快速擴增技術-聚合酶鏈式反應（rapid-amplification of cDNA ends-polymerase chain reaction，RACE-PCR）技術分離了杏的2 個PAL基因，分別為ParPAL1和ParPAL2，并做了cDNA全長克隆和氨基酸序列比對，結(jié)果顯示杏中的PAL基因與其他直系同源的植物同源性較高，其中ParPAL1參與黃酮類化合物的合成。靳禎亮[22]為了研究麥角硫因抑制采后雙孢蘑菇酶促褐變的效應與機理，對PAL基因做了相對表達量分析，結(jié)果表明麥角硫因抑制了PAL1和PAL2基因的表達，從而抑制了雙孢蘑菇的褐變。但是卻鮮有關于鴨梨果實PAL基因的研究，目前只有閆洪波等[23]對鴨梨果實PAL基因進行了克隆及表達的分析，在鴨梨中獲得了2 個PAL基因，分別命名為PbPAL1和PbPAL2。本實驗采用緩慢降溫和急速降溫的方法處理晚采鴨梨后進行貯藏，通過觀察這兩種處理的鴨梨在貯藏期間的各項生理指標及PAL活力的變化和PbPAL1和PbPAL2這兩種基因的表達特性，來進一步分析PAL基因表達對鴨梨褐變的影響，以期從分子水平找到控制鴨梨果心褐變的方法，從而降低鴨梨果心褐變導致的相關經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd. cv. Yali）采自河北省深州市，根據(jù)當?shù)剞r(nóng)戶大量采收經(jīng)驗，9月中旬為適時采收期，本實驗鴨梨采自2015年9月23日（可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)為13.1%，果實硬度為10.36 kg/cm2），為晚采鴨梨。晚采鴨梨果實質(zhì)量約230 g，無機械傷、無蟲害，采后套網(wǎng)套裝入內(nèi)襯保鮮膜（大小85 cm×70 cm、厚度0.05～0.06 mm、孔徑15～20 μm，由國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心生產(chǎn)）的紙箱中運抵天津農(nóng)學院冷庫。

硼酸 天津市科密歐化學試劑有限公司；硼酸鈉 天津市科威有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、氯仿、異丙醇、乙醇（均為國產(chǎn)分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；β-巰基乙醇 北京索萊寶科技有限公司；L-苯丙氨酸 廣州翔博生物科技有限公司；MM032 RNA提取試劑盒、MM061 cDNA Synthesis Kit、MQ051 2×SYBR Green qPCR Master mix 江蘇ProbeGene公司。

1.2 儀器與設備

CA-10 CO2測定儀 美國Sable Systems儀器公司；GC-14C氣相色譜儀 日本島津公司；TA.XT. Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems儀器公司；2000c型紫外分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific科技有限公司；VORTEX-GENIE2漩渦混勻器 江蘇天翎儀器有限公司；ABI2720 PCR儀器 美國應用生物系統(tǒng)公司；Gene9600定量PCR儀器 杭州博日科技有限公司；Multifuge1L-R高速冷凍離心機 德國Hermle公司；ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)美國Bio-Rad有限公司；雪花狀制冰機 日本SANYO公司；超凈工作臺 蘇凈集團；Synergy超純水機美國Millipore公司；TanonES100電泳儀 上海朗賦實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預處理

晚采鴨梨分2 個處理，分別為急速降溫和緩慢降溫。急速降溫：將采摘的鴨梨直接放入（0±1）℃的冷庫貯藏；緩慢降溫：將采摘的鴨梨先放入（12±1）℃的冷庫中預冷，待品溫到12 ℃時開始降溫，每5 d降溫2 ℃，用6 個周期將溫度降到（0±1）℃貯藏（從放入冷庫開始計貯藏時間）。樣品每30 d進行1次實驗，隨機從2 個處理組的鴨梨中分別選取45 個果，15 個果做生理指標測定；將剩下的30 個果沿果心外側(cè)切分果實，迅速將果心切成塊狀用液氮急凍，然后置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｒ再A藏0 d的鴨梨果實（即為剛采摘的新鮮鴨梨）作對照組。

1.3.2 果實生理指標的測定

果心褐變指數(shù)的測定：沿鴨梨果實果心的外側(cè)線切分果實，觀察果實橫切面果心部位的褐變情況。褐變級別分為4級：無褐變?yōu)?級，果心子房內(nèi)壁出現(xiàn)褐斑為1級，1～2 個果心子房室褐變（果心褐變面積20%～50%）為2級，3～4 個果心子房室均出現(xiàn)褐變（褐變面積50%～80%）為3級，果心子房室全部褐變（褐變面積80%～100%）為4級。將每次實驗選取的45 個果分3 次統(tǒng)計作為平行，每次統(tǒng)計15 個。褐變指數(shù)按照下式計算。

果實質(zhì)量損失率參考鄧冰等[24]的方法測定；果實硬度參考鄧冰等[25]的方法，采用質(zhì)構(gòu)儀測定；呼吸強度和乙烯釋放量參考韓云云等[26]的方法測定。

1.3.3 PAL活力的測定

參考Christopoulos[27]、Hussain[28]、周曉婉[29]等的方法并做修改進行測定。

1.3.4 鴨梨果心總RNA的提取

采用ProbeGene MM032 RNA提取試劑盒進行提取。根據(jù)瓊脂凝膠電泳以及NanoDrop2000超微量分光光度計測定結(jié)果，提取的總RNA完整、濃度高，且OD260nm/OD280nm均在1.9～2.1之間，說明提取的總RNA質(zhì)量高，適合用作下一步實驗。

1.3.5 引物設計與合成

根據(jù)GenBank中pPAL1和pbPAL2的cDNA序列信息（GU906268.1、GU906269.1）設計特異性引物。采用pbACT2（登錄號：GU830958.1）作為內(nèi)參基因[30]。引物設計由ProbeGene完成設計，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR特異性引物序列及擴增特性見表1。

表 1 qRT-PCR特異性引物序列及擴增特性Table 1 Specific primer sequences and amplification characteristics used for qRT-PCR

1.3.6 cDNA第一鏈的合成

反轉(zhuǎn)錄反應體系：5×RT Buffer 10 μL、RT Enzyme Mix 2.5 μL、dNTPs 2.5 μL、Oligo(dT)15或Random hexamers 1.25 μL、模板RNA 2～3 g，RNase free ddH2O補至50 μL。第一鏈合成反應程序：50 ℃、60 min逆轉(zhuǎn)錄，85 ℃、5 min逆轉(zhuǎn)錄酶熱失活。將cDNA產(chǎn)物在-20 ℃下儲存或立即用于PCR。

1.3.7 qRT-PCR體系及程序

qRT-PCR體系：2×SYBR Green qPCR Master Mix 5 μL和50 μmol/L 正、反向引物各0.1 μL，模板DNA（根據(jù)DNA和cDNA濃度調(diào)整）補齊至10 μL。

qRT-PCR程序：95 ℃預變性10 min；然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)。每個基因設置3 個平行。反應結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，采用溴化乙錠染色，由全能型凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像后確認是否與擴增曲線結(jié)果吻合。最后再采用2-ΔΔCt法[31]計算基因的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析。用SPSS17.0軟件中的Duncan檢驗進行數(shù)據(jù)間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降溫方式對鴨梨果心褐變指數(shù)的影響

圖 1 降溫方式對果心褐變指數(shù)的影響Fig. 1 Effects of different cooling methods on browning index of the fruit core

果心褐變指數(shù)是顯示褐變嚴重程度的一個指標，既可以反映出果實整體的褐變情況，也可以反映出單個果心的褐變程度。如圖1所示，從貯藏60 d開始，兩種處理的鴨梨果心褐變指數(shù)均出現(xiàn)了極顯著差異（P＜0.05）。在貯藏30 d時，兩組均未出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。在貯藏60 d時，緩慢降溫處理的鴨梨不僅出現(xiàn)了較多數(shù)量的褐變果，而且單果出現(xiàn)了褐變程度為3 級的果實，其褐變指數(shù)達到0.32；而急速降溫處理的鴨梨只出現(xiàn)了1 級褐變果，褐變指數(shù)僅為0.02。在貯藏60 d后，緩慢降溫處理組鴨梨的褐變情況比急速降溫組嚴重。說明采收成熟度較高的鴨梨可能不適合采用緩慢降溫的方式處理。成熟度較高的果實，采摘后經(jīng)過緩慢降溫處理長達30 d，加速了鴨梨果實的衰老，從而導致褐變加重[32]。

2.2 降溫方式對鴨梨質(zhì)量損失率及硬度的影響

圖 2 降溫方式對鴨梨質(zhì)量損失率（a）和硬度（b）的影響Fig. 2 Effects of different cooling methods on mass loss rate (a) and hardness (b) of ‘Yali’ pears

質(zhì)量損失率和硬度均是反映鴨梨果實品質(zhì)的重要指標，由圖2a中可以看出，整個貯藏期間，果實質(zhì)量損失率處于上升趨勢。在貯藏前30 d，急速降溫的果實質(zhì)量損失速率明顯高于緩慢降溫的果實。貯藏30 d以后，緩慢降溫果實的質(zhì)量損失率均高于急速降溫果實，尤其在貯藏120 d后質(zhì)量損失率上升較快。說明緩慢降溫一方面加速了果實水分的散失；另一方面在貯藏末期可能由于營養(yǎng)物質(zhì)的損耗也導致了質(zhì)量損失率的快速增加。由圖2b可知，兩種降溫方式處理的果實硬度在貯藏期間均處于下降趨勢，且急速降溫果實的硬度基本上均高于緩慢降溫的果實。說明急速降溫處理既可以減緩鴨梨果實質(zhì)量的下降，還可以保持果實的硬度。從這兩個生理指標來看，緩慢降溫不適合用于成熟度較高的晚采鴨梨，會加速緩慢降溫過程中鴨梨果實的衰老和褐變[33]，降低果實品質(zhì)。

2.3 降溫方式對鴨梨果實呼吸強度及乙烯釋放量的影響

鴨梨屬于典型的呼吸躍變型果實，在采后貯藏過程中出現(xiàn)明顯的呼吸高峰和乙烯釋放高峰是果實成熟、衰老的重要標志[34]。由圖3可知，鴨梨在整個貯藏期間出現(xiàn)了呼吸高峰和乙烯釋放高峰。由圖3a可知，貯藏過程中鴨梨的呼吸高峰出現(xiàn)在第60天，在貯藏期緩慢降溫果實的呼吸強度整體上高于急速降溫果實。由圖3b可知，整個貯藏期間，緩慢降溫果實的乙烯釋放量均明顯高于急速降溫果實，在貯藏90 d時均出現(xiàn)了比較明顯的乙烯釋放高峰，且二者差異顯著（P＜0.05）。果實的呼吸強度與乙烯釋放量出現(xiàn)高峰的時間與果心褐變出現(xiàn)的時間相對較吻合，說明果實的呼吸強度和乙烯釋放量可能與鴨梨果心褐變密切相關。

圖 3 降溫方式對鴨梨呼吸強度（a）和乙烯釋放量（b）的影響Fig. 3 Effects of different cooling methods on respiratory intensity (a)and ethylene production rate (b) of ‘Yali’ pears

2.4 降溫方式對鴨梨果心PAL活力的影響

圖 4 降溫方式對鴨梨果心PAL活力的影響Fig. 4 Effects of different cooling methods on PAL activity of the fruit core

PAL是苯丙氨酸途徑中的關鍵酶，在植物生長、發(fā)育、抗逆性等方面起著關鍵作用[35]。PAL活力是植物抗逆性表現(xiàn)的一個生理指標[36-37]。由圖4可知，兩種處理的鴨梨果心PAL活力均為先上升后下降然后上升的變化趨勢。其中緩慢降溫果實PAL活力上升的程度比急速降溫果實低，且很快再次處于上升趨勢；而急速降溫果實PAL活力上升到30 d時開始下降，直到貯藏末期（120 d）；這可能是由于鴨梨從室溫下進入冷庫環(huán)境，受到冷害脅迫，激活了PAL的活力，使果實啟動了冷害防御系統(tǒng)[23,38]。但是緩慢降溫果實所處冷庫溫度為梯度降溫模式，溫度比較高，受到冷害脅迫不嚴重，使PAL活力在貯藏30 d時明顯低于急速降溫果實（P＜0.05）。從貯藏60 d開始，緩慢降溫果實的PAL活力持續(xù)上升，可能由于緩慢降溫果實經(jīng)過梯度降溫，處于較高溫度下長達1個月，使成熟度較高的果實內(nèi)酚類物質(zhì)不斷消耗，進一步激活PAL活力[36]。而急速降溫果實的PAL活力在30 d以后開始下降，說明鴨梨適應了低溫環(huán)境，PAL的抗逆作用完成，這與歐陽光察等[39]的研究結(jié)果一致，都是遇到脅迫后PAL活力急劇上升達到高峰，然后急劇下降。在整個貯藏期間，緩慢降溫處理果實的PAL活力在貯藏60 d以后一直高于急速降溫果實，說明急速降溫處理在一定程度上抑制了PAL活力。

根據(jù)PAL活力的變化趨勢結(jié)合果心褐變指數(shù)變化分析，緩慢降溫果實在貯藏60 d時褐變指數(shù)急劇升高，褐變嚴重，可能由于在貯藏60 d時PAL活力逐漸升高，促進了酚類物質(zhì)的合成與積累，加速了鴨梨果心的褐變。而急速降溫果實的褐變指數(shù)一直處于較低水平，這與急速降溫果實的PAL活力處于下降趨勢密切相關；120 d后急速降溫果實的PAL活力又開始上升，而褐變指數(shù)上升不明顯，這可能是由于貯藏后期果實衰老嚴重，刺激抗逆系統(tǒng)，提高了PAL活力，但其活力依然低于緩慢降溫果實。

2.5 降溫方式對鴨梨果心PAL基因相對表達的影響

2.5.1 總RNA提取及引物設計特異性檢測

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳及溶解曲線的結(jié)果可以檢驗擴增產(chǎn)物的特異性。選取的內(nèi)參基因為pbACT2基因，該內(nèi)參基因在鴨梨組織內(nèi)部均穩(wěn)定且高度表達，其表達水平與目標基因相似，則所選內(nèi)參基因符合實驗要求。使用表1中所示的引物對內(nèi)參基因及晚采鴨梨的PAL1、PAL2基因做了反轉(zhuǎn)錄擴增，三者分別得到104、198、132 bp的擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物的溶解溫度分別為84.4、88.2、86.9 ℃，它們的溶解曲線均呈現(xiàn)尖銳單峰，沒有引物二聚體或者其他產(chǎn)物信號出現(xiàn)，說明引物特異性較好。采用LinRegPCR algorithm軟件計算擴增產(chǎn)物的擴增效率，其PCR擴增效率在97%～100%之間，基于標準曲線得到的相關系數(shù)均高于0.999 5。沒有添加模板的對照組中沒有檢測到熒光信號。

2.5.2 降溫方式對鴨梨果心PAL基因相對表達的影響

圖 5 降溫方式對鴨梨果心PAL1（a）和PAL2（b）基因相對表達量的影響Fig. 5 Effects of different cooling methods on the relative expression of PAL1 (a) and PAL2 (b) gene of the fruit core

目前鴨梨PAL基因有兩個家族成員，分別為PbPAL1（GU906268.1）和PbPAL2（GU906269.1）[23]。本實驗將貯藏30 d的PAL基因的相對表達量作為1進行比較。從圖5a、b中都可以看出緩慢降溫處理的鴨梨果心PAL基因相對表達量在貯藏前期隨著時間的延長逐漸增加，直到貯藏后期（120 d），相對表達量開始下降；可能由于果實經(jīng)過緩慢降溫處理后，果實經(jīng)過長達1個月的高溫環(huán)境，酚類物質(zhì)不斷被消耗，使得PAL基因的表達逐漸升高，直到貯藏后期果實衰老嚴重，導致PAL基因表達量降低[18]。而經(jīng)過急速降溫處理的鴨梨果心PAL的相對表達量在貯藏30～60 d期間突然升高，可能是由于鴨梨從室溫下突然進入（0±1）℃的冷庫環(huán)境下，受到冷害脅迫，激活了PAL基因的表達，尤其是PAL1基因的表達，從而啟動了防御機制，抑制了成熟度較高的晚采鴨梨果心褐變。在貯藏期間，緩慢降溫果實的PAL基因相對表達量在貯藏60 d以后均明顯高于急速降溫果實。說明急速降溫處理一定程度抑制了PAL基因的表達。

2.6 PAL基因相對表達量與鴨梨果實各生理指標的相關性分析

表 2 PAL基因相對表達量與生理指標的相關性分析Table 2 Correlation analysis between PAL gene relative expression and physiological indexes

如表2所示，兩種降溫方式下PAL1基因與PAL2基因的相對表達量極顯著相關。PAL1與PAL2基因的相對表達量與果心褐變指數(shù)、呼吸強度均顯著相關。而PAL基因與乙烯釋放量相關性不顯著，但是緩慢降溫處理組的乙烯釋放量在貯藏150 d之前與兩個PAL基因的相對表達量變化趨勢是一致的，只是乙烯高峰出現(xiàn)的時間比對應的PAL基因的表達量峰值提前了30 d，說明PAL不僅是合成酚類物質(zhì)的關鍵酶，還與抗性信號物質(zhì)乙烯的生物合成密切相關[40]。PAL基因的相對表達量與生理指標的相關性說明PAL基因相對表達量與鴨梨果心褐變密切相關。

3 討 論

緩慢降溫處理適時采收的鴨梨，可以有效抑制鴨梨果心褐變，延長鴨梨的貯藏期，提高鴨梨的貯藏品質(zhì)[41]；這是因為適時采收的鴨梨抗冷能力較差，急速降溫處理會使果實發(fā)生冷害，導致果心褐變。而成熟度較高的鴨梨抗冷性好，不易發(fā)生冷害，采用緩慢降溫處理會使晚采鴨梨進行后熟，更容易加快果實的衰老和褐變[42]。生產(chǎn)上采收期較晚的鴨梨可以直接入庫進行貯藏，無需進行緩慢降溫處理。

PAL是連接初級代謝和苯丙烷類代謝的第一步反應酶[43]。淀粉類物質(zhì)經(jīng)過莽草酸途徑產(chǎn)生L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸經(jīng)過PAL催化反應生成反式肉桂酸，進一步生成木質(zhì)素、黃酮、綠原酸等碳化物。這些代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，而這些物質(zhì)與PAL密切相關，因此PAL對植物的生理意義非常巨大[44]。一方面，PAL促進綠原酸等酚類物質(zhì)合成，酚類物質(zhì)又是PPO的前體物質(zhì)，PPO是促進果實褐變的關鍵酶，PAL與PPO的協(xié)同作用，促進了鴨梨果實褐變[15,45]；另一方面，PAL催化產(chǎn)生植保素、木質(zhì)素等植物抗逆系統(tǒng)的主要物質(zhì)，果實受到病害、冷害等脅迫時，就會激活PAL基因的表達，啟動抗病、抗冷等抗逆系統(tǒng)，從而保護植物免受傷害[46]。植物所處的環(huán)境不同，PAL的作用可能不同。本實驗中緩慢降溫處理，PAL可能參與產(chǎn)生酚類物質(zhì)合成途徑，加速了果心的褐變；而急速降溫處理可能使果實啟動冷害防御系統(tǒng)產(chǎn)生抗逆反應，抑制了果實的褐變。鑒于PAL在植物體內(nèi)的多重作用，還需要進一步研究PAL基因作用機理。

PbPAL1與PbPAL2基因分別為PAL基因的家族成員，也是目前在鴨梨果實內(nèi)全長克隆的與褐變相關的僅有的兩個成員。根據(jù)實驗結(jié)果，當鴨梨果實受到冷害脅迫時，PAL1基因的相對表達量上升程度高于PAL2基因，說明PAL1在抗逆反應中比較敏感。這與閆洪波等[23]的實驗結(jié)果相似，即PAL1基因在受到脅迫后1 h表達量開始上升，而PAL2的表達量在脅迫后12 h才開始上升。但這兩種基因的功能基本相同，兩者相對表達量極顯著相關（P＜0.01）。

本實驗采用緩慢降溫和急速降溫兩種降溫方式專門針對采收期較晚、成熟度較高的鴨梨果實進行實驗，通過測定晚采鴨梨的果心褐變指數(shù)、質(zhì)量損失率、硬度、呼吸強度及乙烯釋放量等生理指標，得知緩慢降溫處理導致鴨梨果心褐變嚴重，僅貯藏60 d，褐變指數(shù)就高達0.32；而急速降溫處理的鴨梨果心褐變指數(shù)僅為0.02。緩慢降溫處理也導致果實硬度下降較快、質(zhì)量損失率較高，果實呼吸強度及乙烯釋放量也比急速降溫處理的高。緩慢降溫處理不僅沒有起到抑制果心PAL活力及其基因表達的作用，反而加速了PAL基因的過量表達，導致鴨梨果心出現(xiàn)嚴重褐變現(xiàn)象。急速降溫處理在貯藏前期激活了PAL基因的表達，啟動了PAL基因參與的抗逆防御系統(tǒng)，抑制了鴨梨果心的褐變。在貯藏中后期PAL表達量均比較低，降低了PAL活力，從而對酚類物質(zhì)的產(chǎn)生起到了抑制作用，進而降低了果實的褐變指數(shù)。這說明PAL活力及其基因的相對表達與鴨梨的褐變密切相關，同時也說明緩慢降溫處理不適合用于成熟度較高的晚采鴨梨，采用急速降溫有利于晚采鴨梨貯藏品質(zhì)的保持。