王江 楊琳紅 魏曉麗

【摘要】 目的：探討Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用，為中耳膽脂瘤的臨床診斷、治療及預(yù)后提供新途徑。方法：收集2016年12月-2017年7月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科經(jīng)病理科證實(shí)的術(shù)中標(biāo)本45例。其中中耳膽脂瘤標(biāo)本30例為試驗(yàn)組，正常外耳道皮膚組織15例為對(duì)照組。采用免疫組化SP法分別檢測(cè)兩組中Caspase-7蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：Caspase-7蛋白在試驗(yàn)組的陽(yáng)性表達(dá)要明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=4.727，P<0.05）。結(jié)論：在中耳膽脂瘤上皮組織中Caspase-7蛋白呈高表達(dá)趨勢(shì)，其陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常外耳道皮膚組織，提示Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

【關(guān)鍵詞】 Caspase-7； 中耳膽脂瘤； 增殖； 凋亡； 免疫組織化學(xué)

【Abstract】 Objective：To explore the roles of Caspase-7 in the progression and development of cholesteatoma of middle ear，then to provide a new approach for the clinical diagnosis，treatment and prognosis of this disease.Method：A total of of 30 epithelial tissues of cholesteatoma of middle ear（the experimental group）and 15 normal epithelial tissues of external auditory canal（the control group）were collected from otolaryngological department of the First Affiliated Hospital of Jiamusi University from December 2016 and July 2017.SP approach of immunohistochemistry was used to examine the expression of two groups.Result：The positive expression rate of Caspase-7 in the experimental group was higher than that in the control group，the difference was statistically significant（字2=4.727，P<0.05）.Conclusion：Caspase-7 is showed high expression trend in epithelial tissues of cholesteatoma of middle ear.And the positive expression rate is significantly higher than the normal epithelial tissues of external auditory canal，suggesting that Caspase-7 plays an important role in the occurrences and developments of the cholesteatoma of middle ear.

【Key words】 Caspase-7； Cholesteatoma of middle ear； Proliferation； Apoptosis；

Immunohistochemistry

First-authors address：Jiamusi University，Jiamusi 154007，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.021

中耳膽脂瘤是耳科的一種常見(jiàn)疾病，也是一種來(lái)自在顳骨鱗狀上皮角化異常形成的邊界清楚的良性囊性病變[1-2]。中耳膽脂瘤雖是良性病變，卻具有類似于腫瘤的特性：持續(xù)增殖性生長(zhǎng)、破壞周圍骨質(zhì)以及向周圍侵襲的能力。鱗狀上皮在慢性感染的情況下逐漸被破壞，再加上膽脂瘤基質(zhì)酶活性的增加，提高了膽脂瘤的溶骨作用[3]。對(duì)于沒(méi)有及時(shí)治療的患者尤其是小兒患者，存在顱內(nèi)并發(fā)癥甚至引起死亡的風(fēng)險(xiǎn)[4]。雖然人們對(duì)中耳膽脂瘤做了大量的研究，但是發(fā)病機(jī)制目前仍然不完全清楚。根據(jù)以往的研究提示凋亡途徑可能是其中一個(gè)重要因素。

Caspase-7 Cysteine aspartate specific protease 7（Caspase-7）是Caspase蛋白家族的重要成員，承擔(dān)著凋亡執(zhí)行的重要任務(wù)，是凋亡通路中必不可少的因子之一。研究表明Caspase-7參與了多種組織中的凋亡過(guò)程[5]，在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)對(duì)Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤中研究的報(bào)道。本次研究采用兔抗人CASP7多克隆抗體，應(yīng)用免疫組化SP法，檢測(cè)Caspase-7蛋白在30例中耳膽脂瘤上皮組織和15例正常外耳道皮膚組織中的表達(dá)情況，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件分析Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤組織中的表達(dá)情況，揭示Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用，并深入探討中耳膽脂瘤與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，為中耳膽脂瘤的臨床診斷、治療及預(yù)后提供新途徑，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年12月-2017年7月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科經(jīng)病理科證實(shí)的術(shù)中標(biāo)本45例。其中中耳膽脂瘤標(biāo)本30例為試驗(yàn)組，正常外耳道皮膚組織15例為對(duì)照組。男20例，女25例，年齡3～74歲，平均48.4歲。所有標(biāo)本均來(lái)自乳突根治術(shù)及中耳探查術(shù)患者，術(shù)后2 h內(nèi)將標(biāo)本經(jīng)10%的中性福爾馬林溶液固定，24 h后將浸潤(rùn)在10%福爾馬林溶液的標(biāo)本用石蠟固定包埋、冷凍，放置4 ℃恒溫冰箱中冷藏待用，實(shí)驗(yàn)時(shí)將包埋石蠟切片每例連續(xù)切片3張，最后通過(guò)蘇木精-伊紅染色，并閱讀切片、記錄。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人CASP7多克隆抗體購(gòu)買于生工生物工程（上海）股份有限公司。PV-8000-1二步法通用試劑盒（6 mL），ZLI-9018 DAB顯色試劑盒（3 mL），ZLI-9029抗體稀釋液（50 mL），ZLI-9062 PBS緩沖液粉末（pH 7.3）10袋/包，均購(gòu)于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。梯度酒精、蒸餾水、二甲苯、中性樹(shù)膠及蘇木精、過(guò)氧化物酶阻斷劑，免疫動(dòng)物血清、SP免疫組化試劑盒、生物素標(biāo)記的第二抗體、PBS枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液均由佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供。

1.2.2 免疫組化 利用免疫組化（SP）四步法檢測(cè)中耳膽脂瘤組織與正常外耳道皮膚組織中Caspase-7與Bak蛋白的表達(dá)情況。將一抗兔抗人CASP7多克隆抗體按照1︰200的濃度進(jìn)行稀釋，同時(shí)利用PBS枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液對(duì)標(biāo)本組織進(jìn)行酸修復(fù)，以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。利用HE染色后用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 所有切片全部采用雙盲法進(jìn)行觀察與計(jì)數(shù)（以病理科兩位正高職稱醫(yī)師為準(zhǔn)），避開(kāi)組織切片的邊緣，選擇明顯強(qiáng)于背景著色處計(jì)數(shù)。每張病理切片至少在高倍鏡（SP×200）下觀察10個(gè)以上不重復(fù)的視野，繼而判斷細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞染色百分比率，并按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分[6]。按照染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分；淡染者1分；中等染色為2分；強(qiáng)染色為3分。染色范圍按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分?jǐn)?shù)計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，10%～25%為2分，25%～50%為3分，50%～75%為4分，>75%為5分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相加后分為四級(jí)：0分（-）；1～2分（+）；3～4分（++）；5～6分（+++）。其中“-“為陰性表達(dá)，”+“為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件包對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本次研究中計(jì)數(shù)資料采用字2檢驗(yàn)、而組間相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過(guò)閱片發(fā)現(xiàn)，Caspase-7蛋白主要定位于胞漿中，其陽(yáng)性信號(hào)為胞漿內(nèi)黃色、棕黃色以及棕色顆粒狀物。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，Caspase-7蛋白幾乎聚集在中耳膽脂瘤上皮的全層，較為密集，見(jiàn)圖1；而在正常外耳道皮膚組織中表達(dá)稀疏，強(qiáng)度較弱，見(jiàn)圖2。通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組陽(yáng)性表達(dá)22例，陽(yáng)性率為73.3%（22/30），其中強(qiáng)陽(yáng)性（+++及以上）表達(dá)12例，強(qiáng)陽(yáng)性率為40.0%（12/30）；而對(duì)照組中僅有6例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為40.0%（6/15），且胞漿中陽(yáng)性信號(hào)較為稀疏，無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Caspase-7蛋白在試驗(yàn)組的陽(yáng)性表達(dá)要明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=4.727，P<0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

中耳膽脂瘤是一種來(lái)自在顳骨鱗狀上皮角化異常形成的邊界清楚的良性囊性病變[1-2]，其局部侵襲性生長(zhǎng)可導(dǎo)致局部正常中耳結(jié)構(gòu)被破壞[3]。鱗狀上皮在慢性感染的情況下逐漸被破壞，再加上膽脂瘤基質(zhì)酶活性的增加，提高了膽脂瘤的溶骨作用[3]。由膽脂瘤進(jìn)步骨侵蝕可導(dǎo)致永久性耳聾，前庭功能障礙，面癱，更致命的顱內(nèi)并發(fā)癥[7]。

前體Caspase-7是由儲(chǔ)存在細(xì)胞質(zhì)中的待組裝的303個(gè)氨基酸組成的同源二聚體[8]。這些同源二聚體是由位于中央的12股β片狀折疊及周圍的10股α螺旋組成的[9-10]。這種所謂的“開(kāi)放α/β桶折疊”包括兩個(gè)相同的反平行排列的酶單位，每個(gè)單位各攜帶一個(gè)特殊的活性位點(diǎn)，每一個(gè)酶單位都是由一大一小兩個(gè)催化亞基（大小分別為20 kDa和11 kDa）組成，它們?cè)贑aspase-7酶原的接頭序列相互連接，而這種連接正好阻礙了活性位點(diǎn)的激活[11]。通過(guò)分別裂解Asp 198和Ser 199以及Ser 199和Ala 207之間的肽鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)連接區(qū)域的斷裂，從而使得環(huán)形結(jié)構(gòu)L2、L3和L4進(jìn)行空間重組并形成活性位點(diǎn)和底物結(jié)合口袋[11]?；罨蟮腃aspase-7會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

大多數(shù)的研究表明Caspase-7在多種組織中參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展[5]，并與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Matalova等[12]在人第一磨牙原發(fā)性釉結(jié)（發(fā)生細(xì)胞凋亡的部位）檢測(cè)出活化的Caspase-7蛋白，同時(shí)在分化的成齒質(zhì)細(xì)胞和釉母細(xì)胞中的非凋亡區(qū)域也檢測(cè)出Caspase-7蛋白。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Caspase-7基因后小鼠切牙釉質(zhì)沉積量顯著減少[13]。Chaudhary等[14]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Caspase-7在乳腺癌組織中的表達(dá)率顯著高于正常組織，并證實(shí)其是乳腺癌發(fā)生的重要因素之一。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Caspase-7與中、高分化的口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)[15]。下調(diào)或抑制Caspase-7蛋白的表達(dá)會(huì)不同程度地降低腫瘤細(xì)胞的增殖[16-17]。這些研究均提示Caspase-7蛋白在腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

根據(jù)大量研究可將中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制分為五類：（1）內(nèi)陷囊袋理論（縮回口袋理論）；（2）上皮侵襲或遷移理論（移植理論）；（3）鱗狀化生學(xué)說(shuō)；（4）基底細(xì)胞增生（乳頭狀生長(zhǎng)理論理論）；（5）黏膜牽引理論[18-19]。但是無(wú)論哪種學(xué)說(shuō)都無(wú)法完美的解釋膽脂瘤的發(fā)病原因。目前學(xué)者們普遍認(rèn)為在中耳膽脂瘤中凋亡水平和增殖水平都要顯著高于正常皮膚，這一結(jié)論早在20世紀(jì)90年代后期已由Kojima等[20]和Ergün等[21]證實(shí)。在此結(jié)論后的研究中不斷發(fā)現(xiàn)新的凋亡因子以及增殖通路在中耳膽脂瘤組織中高表達(dá)，這也表明了在中耳膽脂瘤組織中凋亡水平與增殖水平達(dá)到了一個(gè)“相對(duì)平衡”的狀態(tài)，阻礙了中耳膽脂瘤向惡性的方向發(fā)展。一方面中耳膽脂瘤組織增殖水平的提高，加快了膽脂瘤上皮細(xì)胞的分化與增殖，使膽脂瘤不斷生長(zhǎng)并破壞周圍臨近正常組織。另一方面由于機(jī)體的“自我保護(hù)”機(jī)制的開(kāi)啟，使得中耳膽脂瘤組織中眾多的凋亡因子被激活，從而激發(fā)了內(nèi)源性及外源性凋亡通路的發(fā)生，使得過(guò)度增殖的膽脂瘤上皮發(fā)生凋亡，其結(jié)果就是大量“鱗屑樣物”的堆積，這也進(jìn)一步促使了中耳膽脂瘤的生長(zhǎng)。

Caspase蛋白家族是凋亡通路中不可或缺的因子，幾乎貫穿著凋亡通路的全過(guò)程。Caspase-7蛋白是Caspase蛋白家族中重要的效應(yīng)因子，在凋亡通路的執(zhí)行階段中起到?jīng)Q定性作用。在本研究中，通過(guò)免疫組化SP法處理了30例中耳膽脂瘤上皮組織與15例正常外耳道皮膚組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在中耳膽脂瘤上皮組織標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率為73.3%（22/30），陽(yáng)性信號(hào)幾乎覆蓋上皮全層，表達(dá)較為密集。而在15例正常外耳道皮膚組織中，陽(yáng)性表達(dá)率僅為40%。通過(guò)此研究發(fā)現(xiàn)Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤上皮中的陽(yáng)性表達(dá)率要高于正常外耳道皮膚組織（字2=4.727，P<0.05）。這一研究結(jié)果表明了Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。同時(shí)也表明了中耳膽脂瘤上皮中的凋亡水平比正常組織要顯著提高，提示凋亡水平的提高也是膽脂瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)不可或缺的因素，也讓我們對(duì)膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制有了更深入的認(rèn)識(shí)。

綜上所述，在中耳膽脂瘤上皮組織中Caspase-7蛋白呈高表達(dá)趨勢(shì)，其陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常外耳道皮膚組織，提示Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Isaacson G.Diagnosis of pediatric cholesteatoma[J].Pediatrics，2007，120（3）：603-608.

[2] Semaan M T，Megerian C A.The pathophysiology of cholesteatoma[J].Otolaryngol Clin North Am，2006，39（6）：1143-1159.

[3] Kuo C L，Shiao A S，Yung M，et al.Updates and knowledge gaps in cholesteatoma research[J].Bio Med Res Int，2015：854024.

[4] Diom E S，Cisse Z，Tall A，et al.Management of acquired cholesteatoma in children：a year review in ENT service of CHNU deFANN Dakar[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2013，77（12）：1998-2003.

[5] Houde C，Banks K G，Coulombe N，et al.Caspase-7 expanded function and intrinsic expression level underlies strain-specific brain phenotype of caspase-3-null mice[J].J Neurosci，2004，24（44）：9977-9984.

[6]邢傳平，劉斌，董亮，等.免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果的判斷方法[J].中華病理學(xué)雜志，2001，30（4）：318

[7] Chole R A.The molecular biology of bone resorption due to chronic otitis media[J].Ann N Y Acad Sci，1997，121（）：95-109

[8] Boatright K M，Renatus M，Scott F L，et al.A unified model for apical caspase activation[J].Mol Cell，2003，11（2）：529-541.

[9] Riedl S J，F(xiàn)uentes-Prior P，Renatus M，et al.Structural basis for the activation of human procaspase-7[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（26）：14790-14795.

[10] Chai J，Wu Q，Shiozaki E，et al.Crystal structure of a procaspase-7 zymogen：mechanisms of activation and substrate binding[J].Cell，2001，107（3）：399-407.

[11] Lamkanfi M，Kanneganti T D.Caspase-7：a protease involved in apoptosis and inflammation[J].Int J Biochem Cell Biol，2010，42（1）：21-24.

[12] Matalova E，Vanden Berghe T，Svandova E，et al.Caspase-7 in molar tooth development[J].Arch Oral Biol，2012，57（11）：1474-1481.

[13] Matalova E，Lesot H，Svandova E，et al.Caspase-7 participates in differentiation of cells forming dental hard tissues[J].Dev Growth Differ，2013，55（5）：615-621.

[14] Chaudhary S，Madhukrishna B，Adhya A K，et al. Overexpression of caspase 7 is ERα dependent to affect proliferation and cell growth in breast cancer cells by targeting p21Cip[J].Oncogenesis，2016，5（4）：e219.

[15] Coutinho-Camillo C M，Lourenco S V，Nishimoto I N，et al. Caspase expression in oral squamous cell carcinoma[J].Head Neck，2011，33（8）：1191-1198.

[16] Hashimoto T，Kikkawa U，Kamada S.Contribution of caspase（s）to the cell cycle regulation at mitotic phase[J].PLoS One，2011，6（3）：e18449.

[17] Hashimoto T，Yamauchi L，Hunter T，et al.Possible involvement of caspase-7 in cell cycle progression at mitosis[J].Genes Cells，2008，13（6）：609-621.

[18] Kuo C L.Etiopathogenesis of acquired cholesteatoma：prominent theories and recent advances in biomolecular research[J].Laryngoscope，2015，125（1）：234-240.

[19] Jackler R K，Santa Maria P L，Varsak Y K，et al.A new theory on the pathogenesis of acquired cholesteatoma：mucosal traction[J].Laryngoscope，2015，125（4）：S1-S14.

[20] Kojima H，Tanaka Y，Tanaka T，et al.Cell proliferation and apoptosis in human middle ear cholesteatoma[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1998，124（3）：261-264.

[21] Ergün S，Carls?? B，Zheng X.Apoptosis in meatal skin，cholesteatoman and squamous cell carcinoma of the ear[J].Clin Otolaryngol Allied sci，1999，24（4）：280-285.