向慶偉

糖尿病的發(fā)生發(fā)展是一個漫長的病理過程，血瘀癥在糖尿病患者中普遍存在[1，2]，研究發(fā)現(xiàn)，血瘀癥在糖尿病并發(fā)癥中約占16%[3]。血瘀癥引起的微循環(huán)障礙、血黏度增高、循環(huán)灌注不足、微血栓形成等是引起周圍神經(jīng)病變的主要原因，可引起肢體疼痛麻木、胸痛頭痛、半身不遂、舌質(zhì)紫暗或有瘀斑瘀點等病理特征，且有權(quán)威研究證實血瘀癥的血液高凝狀態(tài)比非血瘀癥者明顯[4，5]。西醫(yī)治療的手段是胰島素藥物控制血糖與甲鈷胺藥物治療[6]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為血瘀癥病位在筋肉、肌膚與脈絡(luò)，涉及肝、腎、脾等臟腑，以氣血陰陽虧虛為本，痰瘀阻絡(luò)為標(biāo)，中醫(yī)治療以益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)為主。水通道蛋白1(AQP1)是中醫(yī)血瘀水停重要參考指標(biāo)，其表達水平與組織血瘀水停關(guān)系緊密；RhoA/ROCK信號通路在體內(nèi)普遍存在，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種細胞功能。相關(guān)研究表明[7，8]，AQP1、RhoA/ROCK信號通路可能成為防治糖尿病血瘀癥的藥物新靶點。當(dāng)歸四逆湯具有回陽救逆之效，以及改善神經(jīng)受損的作用。本研究旨在探究當(dāng)歸四逆湯是否可通過調(diào)節(jié)AQP1、RhoA/ROCK信號通路促進糖尿病血瘀癥大鼠神經(jīng)元恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥劑和儀器

1.1.1實驗動物：健康成年雄性SD大鼠65只(6-8周齡，體重200-250g)，購自北京華埠康生物技術(shù)有限公司[scxk(京)2016-0275]。在SPF系統(tǒng)內(nèi)分籠飼養(yǎng)，12h循環(huán)光照，室溫23±1℃、濕度50%-60%，自由攝食和飲水。飼養(yǎng)一周后進行實驗。

1.1.2主要藥物和試劑：當(dāng)歸四逆湯組成及劑量源于《傷寒論》：當(dāng)歸(批號14003095)12g、桂枝(批號14019611)9g、細辛(批號14015080)、赤芍(批號14016022)9g、通草(批號14013827)6g、灸甘草(批號14056230)6g、大棗8枚，中藥飲片均來源于湖北中醫(yī)院藥房，由本院制劑中心煎制(將飲片置于冷水中浸泡30min，水提取3次，合并濾液，配制成含生藥1mg/ml的藥液，置于冰箱待用)；甲鈷胺片劑(衛(wèi)材藥業(yè)股份公司，批號20161123，使用時用蒸餾水溶解成所需濃度)；STZ(鏈脲佐菌素，粉劑，Sigma-Aldrich，批號S0130，使用時溶于0.1mol/L、pH4.2的檸檬酸緩沖液)；二水合檸檬酸鈉，檸檬酸(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，批號20150625，20150628)； AQP1抗體(Santa Cruz，批號sc-32738，使用時1∶500稀釋)； RhoA抗體(Abcam，批號ab54835，使用時1∶1 000稀釋)； ROCKI抗體(Abcam，批號ab45171，使用時1∶2 000稀釋)；ROCKII抗體(Abcam，批號ab66320，使用時1∶2 000稀釋)；β-actin抗體(Mouse 北京康貝源科技有限責(zé)任公司)；二抗均為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠 IgG( Thermo Scientific，使用時1∶5 000稀釋)；強的松龍注射液(針劑，浙江仙居制藥股份有限公司，批號1067227)；腎上腺素注射液(針劑，北京市永康藥業(yè)有限公司，批號05030141)；普通鼠糧、高脂鼠糧(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物有限工程責(zé)任公司)。

1.1.3主要儀器：萊卡顯微鏡(型號DM1000，德國Leica)；電生理記錄儀(型號SLY-B，上海美普達儀器有限公司)；蛋白檢測儀(型號AZ1901，美國Bio-Rad)；核酸檢測系統(tǒng)(型號NSB98013，美國Thermo)；Real-Time PCR 檢測系統(tǒng)(型號CFX96)和數(shù)據(jù)處理軟件(型號BD339，美國Bio-Rad)；低溫高速離心機(型號KL04A，湖南湘儀離心機儀器有限公司)；Western blot全能轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；天平(型號FA2004B，上海平軒科學(xué)儀器有限公司)；血糖儀(型號06583211001，愛爾蘭Roche)；血流變儀(型號0832014，德國HAAK)；血脂檢測儀(型號HF-800A，濟南漢方醫(yī)療器械有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(型號101A，蘇州凡貝節(jié)能電熱烘箱有限公司)；PVDF膜(0.22μm 北京索寶生物科技有限公司)；發(fā)光成像儀(型號LAS 4000，德國Healthcare)。

1.2 復(fù)制DM血瘀癥大鼠模型[9]及分組處理

1.2.1制模：留取12只SD大鼠作為正常對照組(A組)普通飼料喂養(yǎng)；另外53只給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)60天，禁食12h后一次性腹腔注射STZ溶液(30mg/kg)，72h后測定空腹血糖，其水平> 16.7mmol/L者為DM模型大鼠；繼續(xù)高脂高糖飼養(yǎng)1周后，肌肉注射強的松龍1ml/次/天，連續(xù)13天，至第14天，一次性肌肉注射0.1%腎上腺素1ml，繼續(xù)高脂高糖飼養(yǎng)2周后，觀察大鼠出現(xiàn)食量、飲水量、尿量增多，體重嚴(yán)重下降，且皮毛無光、精神萎靡、舌面干燥少苔、空腹血糖依然高于16.7mmol/L，同時檢測甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、低密度蛋白(LDL-C)和全血低切黏度、全血高切黏度、血漿黏度等均顯著高于正常對照組，確認(rèn)為DM血瘀癥大鼠造模成功。本次共48只大鼠成模，另3只失敗，2只死亡。

1.2.2分組及處理： 48只成模大鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組：DM血瘀癥組(B組)、甲鈷胺治療組(C組)、當(dāng)歸四逆湯低劑量治療組(D組)和高劑量治療組(E組)，每組12只。C組給予甲鈷胺溶液灌胃(50μg/kg，1次/天)[10]；D組、E組分別給予含生藥1g和2g當(dāng)歸四逆湯灌胃，1次/天。三組每次灌胃量均為2ml；B組和A組給予等量生理鹽水灌胃；均連續(xù)8周。

1.3 檢測指標(biāo)和方法

各組干預(yù)結(jié)束后，先行坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定，之后斷頭處死大鼠，取坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)，分別測定坐骨神經(jīng)含水量、AQP1，RhoA、ROCKI/ROCKII mRNA和蛋白表達水平。

1.3.1坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)檢測：各組大鼠腹腔注射硫噴妥鈉麻醉后，將刺激電極置于左側(cè)坐骨切跡，記錄電極置于左踝部和左爪任意兩趾間，連接電生理記錄儀，記錄神經(jīng)干動作電位。計算NCV(m/s)=刺激電極和記錄電極間距離(m)/動作電位潛伏期(s)。

1.3.2坐骨神經(jīng)含水量測定：將所取大鼠單側(cè)坐骨神經(jīng)遠端組織稱取濕重后，置于58℃烘箱內(nèi)72h稱其干重。計算組織含水量[=(濕重-干重)/濕重×100%]。

1.3.3RT-PCR檢測背根神經(jīng)節(jié)各因子mRNA表達：取背根神經(jīng)節(jié)用液氮研磨，采用Trizol法常規(guī)提取總RNA。按照HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，引物2μl、RNA模板2μl、加RNase-Free water至15μl，65℃孵育5min后立刻冰浴，低溫瞬時離心。繼續(xù)向以上反應(yīng)液中加入5×RT混合液4μl、HiFi-MMLV酶混合液1μl，37℃孵育40min，隨后70℃保持15min終止反應(yīng)。Bio-Rad CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)上進行RT-PCR，反應(yīng)體系為25μl：正義和反義引物各1μl(各引物序列見表1)，各基因模板2μl，SYBR Green PCR預(yù)混體系12.5μl(使用時注意避光)，加無菌水至總體積為25μl。兩步法PCR擴增程序為預(yù)變性95℃10min，隨后變性95℃5s、退火/延伸30s，循環(huán)40次；AQP1、RhoA、ROCKI及ROCKII退火溫度分別為60.0℃，62.0℃，57.0℃和55.0℃。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以=2-△△Ct法計算各基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.3.4Western blot檢測背根神經(jīng)節(jié)各因子蛋白表達：取背根神經(jīng)節(jié)組織，加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液和PMSF(100∶1)裂解30min，4℃、10 000r/min離心10min，取上清使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。SDS-page電泳及蛋白電轉(zhuǎn)后，以5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉1h，Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)洗膜3次，每次5min；滴加相應(yīng)的一抗37℃孵育1h，洗滌3次，滴加相應(yīng)二抗37℃孵育1h，TBST洗滌3次后蒸餾水洗滌2min。以β-actin為內(nèi)參，PVDF膜顯影后使用ImageJ軟件對條帶灰度值進行定量分析，以目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度比值表示該蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 模型大鼠體重、血糖、血脂、血流變等變化

DM血瘀癥模型大鼠均出現(xiàn)“三多”癥狀，精神不振、皮毛無光澤、舌面干燥少苔，甚或瘀點瘀斑。同時體重明顯降低，血糖、血脂、學(xué)流變指標(biāo)水平明顯高于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 DM血瘀癥模型組與對照組大鼠體重、血糖、血脂及血流變指標(biāo)水平比較

注：與對照組比較，1)P<0.01

2.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和含水量比較

方差分析顯示，各組大鼠傳導(dǎo)速度組間差異不顯著(P>0.05)，各組大鼠坐骨神經(jīng)含水量組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。B組含水量較A組顯著增加(t=16.710,P<0.01)，C組、D組、E組含水量均較B組顯著減少(t=14.676、7.847、15.184，P<0.01)，C組、E組含水量減少至與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.034、1.526，均P>0.05)。見表3。

表3各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和含水量比較均=12)

注：與A組比較，1)P<0.01;與B組比較，2)P<0.01

2.3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)AQP1、RhoA、ROCKI和ROCKII mRNA表達比較

方差分析顯示，各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)AQP1、RhoA 和ROCKII mRNA表達水平組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，而各組ROCKI mRNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。B組AQP1 mRNA表達量較A組顯著增加(t=8.378,P<0.01)，但RhoA 和ROCKII mRNA表達水平較A組顯著降低(t=9.532、8.743,P<0.01)。C組AQP1、RhoA和ROCKII mRNA表達水平較B組明顯下調(diào)或上調(diào)(t=6.998、8.095、7.528，均P<0.01)，并接近于A組(t=0.170、0.171、0.409，均P>0.05)。D組AQP1 mRNA表達顯著高于C組(t=5.760,P<0.01)，RhoA和ROCKII mRNA表達顯著低于C組(t=3.633、4.335，均P<0.01)。E組AQP1、RhoA和ROCKII mRNA表達與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.055、0.411、1.318，均P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠AQP1、RhoA、ROCKI和 ROCKII mRNA表達比較均=12)

注：與A組比較，1)P<0.01;與B組比較，2)P<0.01，與C組比較，3)P<0.01

2.4 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)AQP1、ROCKI、RhoA和 ROCKII蛋白表達比較

方差分析顯示，各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)AQP1、RhoA 和ROCKII 蛋白表達水平組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，而各組ROCKI蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。B組AQP1蛋白表達較A組顯著增加(t=7.009,P<0.01)，而RhoA和ROCKII蛋白表達較A組顯著降低(t=7.948,7.881 均P<0.01)。C組AQP1蛋白表達較B組明顯降低(t=8.578,P<0.01)，RhoA和ROCKII蛋白表達則較B組明顯升高(t=7.760、9.996,P<0.01)，且均接近A組(t=0.845、0.699、0.179,P>0.05)；D組AQP1蛋白表達顯著高于C組(t=9.071,P<0.01)，RhoA蛋白表達顯著低于C組(t=2.270,P<0.05)，ROCKII蛋白表達與C組差異不明顯(t=0.255,P>0.05)。E組AQP1蛋白表達低于D組(t=9.071,P<0.01)，與C組相當(dāng)(t=0.329,P>0.05)，RhoA蛋白表達高于D組(t=2.434,P<0.05)，ROCKII蛋白表達與D組接近(t=0.787,P>0.05)；E組AQP1、RhoA和ROCKII蛋白表達與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.329、0.699、1.857,P>0.05)。見圖1、表5。

圖1 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)AQP1、RhoA、ROCKI和ROCKII蛋白電泳圖(Western blot)

組別AQP1 RhoA ROCKI ROCKII A組1.020±0.1580.985±0.2460.998±0.3030.373±0.094B組2.137±0.5291)0.357±0.1201)0.983±0.1550.105±0.0711)C組1.213±0.1742)0.905±0.3112)0.976±0.3400.366±0.0982)D組1.688±0.5131)2)3)0.648±0.2351)2)3)0.937±0.2260.281±0.0852)E組1.245±0.2882)4)0.899±0.2692)4)0.968±0.2770.311±0.1011)2)F值23.79013.3300.09017.370

注：與A組比較,1)P<0.05；與B組比較,2)P<0.05；與C組比較，3)P<0.05；與D組比較,4)P<0.05

3 討論

糖尿病神經(jīng)病變最早出現(xiàn)在感覺神經(jīng)纖維中，其神經(jīng)變性和再生同時存在[11，12]。然而，周圍神經(jīng)再生在糖尿病神經(jīng)病變進展中的作用及其機制尚不清楚。AQP1是中醫(yī)血瘀水停重要參考指標(biāo)，其表達量變化與組織血瘀水停關(guān)系緊密，與中醫(yī)“活血利水”作用相關(guān)[13-15]。大量中醫(yī)臨床研究結(jié)果表明，當(dāng)歸四逆湯治療糖尿病周圍神經(jīng)病變療效明顯[16，17]。

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病血瘀癥模型大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著減慢，且AQP1 mRNA及蛋白表達水平均顯著增加，提示糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生可能通過上調(diào)AQP1，大量水分子進入神經(jīng)纖維，造成神經(jīng)組織水腫，影響其代謝，最終導(dǎo)致其壞死；另外，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病血瘀癥大鼠模型中RhoA、ROCKⅡ的mRNA及蛋白表達水平均明顯下降，說明在疾病狀態(tài)下，突觸的延伸受到了抑制，從而造成疼痛，這與相關(guān)研究[18]結(jié)果一致，而ROCKⅠ的表達水平無明顯變化，可能與ROCKⅠ并不在腦組織表達相關(guān)。RhoA/ROCK信號通路處于多種信號通路的上游，起分子開關(guān)作用，參與多種疾病的病理生理過程，如神經(jīng)病變等[17]。RhoA是一種小分子G蛋白，ROCK為其下游激酶，是RhoA的效應(yīng)因子。ROCK主要有ROCKⅠ和ROCKⅡ兩種亞型，ROCKⅡ在腦組織高表達，而ROCKⅠ主要在肝、脾、腎等組織表達，糖尿病可導(dǎo)致RhoA和ROCK的表達增強[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)給予當(dāng)歸四逆湯高劑量治療的糖尿病大鼠，其神經(jīng)水腫并未發(fā)現(xiàn)明顯改變，AQP1表達也受到了較明顯的抑制，并且與正常組和甲鈷胺組相比較，RhoA/ROCK信號通路表現(xiàn)出明顯的回調(diào)，側(cè)面證明該藥在保護糖尿病對周圍神經(jīng)損害中的作用。結(jié)合以往報道分析其原因，首先，當(dāng)歸四逆湯功能養(yǎng)血補血、溫陽祛瘀；其次，AQP1的表達變化與組織血瘀水停關(guān)系密切。本實驗發(fā)現(xiàn)：血瘀癥可激活A(yù)QP1和RhoA/ROCK信號通路啟動周圍組織水液轉(zhuǎn)運，出現(xiàn)坐骨神經(jīng)水腫，反映了瘀血水停的分子基礎(chǔ)；當(dāng)歸四逆湯可有效抑制AQP1的表達，同時能夠調(diào)節(jié)RhoA/ROCK信號通路相關(guān)因子的表達，從而緩解血瘀癥狀。表明當(dāng)歸四逆湯緩解血瘀癥符合中醫(yī)“活血利水”的理論。甲鈷胺是常用的治療周圍神經(jīng)痛的藥物[19，20]，本研究給予甲鈷胺治療后，各因子表達均有明顯改善，說明該藥物的療效明確，這一結(jié)果也與其它研究一致[21]。而當(dāng)歸四逆湯低劑量組這些指標(biāo)與對照組和甲鈷胺組在這些指標(biāo)上均有差異，表明當(dāng)歸四逆湯存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。比較當(dāng)歸四逆湯高劑量與甲鈷胺治療糖尿病大鼠，兩者療效相當(dāng)，說明在中醫(yī)理論指導(dǎo)下的中藥治療法是一種安全有效的治療方法，值得進一步研究推廣。由于本實驗未進行可能作用靶點的具體機制性研究，因此，這部分將是后續(xù)的工作要點。

綜上所述，當(dāng)歸四逆湯能夠治療糖尿病周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷，同時抑制AQP1表達，減少神經(jīng)水腫引起的缺氧性損傷，并調(diào)節(jié)RhoA/ROCK信號通路相關(guān)因子的表達，其具體的治療作用可能與抑制水腫、增強突出延伸有關(guān)，為今后臨床研究提供一定依據(jù)，也為糖尿病周圍神經(jīng)損傷的靶向治療提供了新的研究方向。

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