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      溶藻菌R1的溶藻特性

      2018-08-31 08:53:12董小娜陳澤慧毛林強(qiáng)王明新張文藝
      關(guān)鍵詞:溶藻微囊銅綠

      董小娜,陳澤慧,毛林強(qiáng),王明新,張文藝

      (常州大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院,江蘇 常州 213164)

      每年夏秋季一些水體均發(fā)生有害藻華(HAB)暴發(fā),給水環(huán)境生態(tài)帶來(lái)極大威脅,探索行之有效的溶藻方法迫在眉睫。利用溶藻菌(algicidalbacteria)溶藻安全高效,具有廣闊前景。近年來(lái),學(xué)者們?cè)谌茉寰暮Y選、溶藻活性代謝產(chǎn)物分析、溶藻微生物的溶藻機(jī)理等方面的研究相當(dāng)活躍,包括溶藻菌株的分離鑒定、溶藻性質(zhì)的描述、溶藻方式的探討、溶藻活性物質(zhì)的分離與純化[1-2]以及溶藻機(jī)理的研究等。尤其溶藻機(jī)理的研究更是深入到基因水平(分子水平):藻細(xì)胞的細(xì)胞水平[3-4]、功能酶和蛋白水平[5-6]等。近年來(lái)溶藻菌的篩選成果頗多[7],已分離鑒定出來(lái)的菌屬有粘細(xì)菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等[8],因藻類(lèi)的暴發(fā)與溶藻菌的生長(zhǎng)息息相關(guān),這些溶藻菌多來(lái)自藻華頻繁暴發(fā)地帶。細(xì)菌溶藻方式主要有2種:直接溶藻與間接溶藻,見(jiàn)諸報(bào)道的溶藻菌多具有間接溶藻特性[9]。對(duì)溶藻能力的測(cè)定方法有:藻細(xì)胞數(shù)量的變化、chl-a含量的變化及其采用藻膽蛋白(某些藻類(lèi)如藍(lán)藻)的含量變化等。對(duì)溶藻機(jī)理的研究越來(lái)越多,眾多分析方法被用于揭示溶藻產(chǎn)物溶藻機(jī)理,如:傅里葉紅外光譜、熒光光譜、透射電鏡等[10]。細(xì)菌分泌的物質(zhì)(如氨基酸、抗生素、多肽等)[11]成分復(fù)雜,不同的溶藻菌分泌有效溶藻成分也不盡相同,這讓溶藻活性物質(zhì)的分離純化非常困難,目前分離純化出有效溶藻物質(zhì)罕見(jiàn)報(bào)道。報(bào)道的溶藻活性物質(zhì)的分離純化主要有2種方法:硅膠柱層析[12]與高效液相色譜(HPLC)方法[13]。對(duì)活性物質(zhì)的鑒定方法有液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)[13]、液相二級(jí)質(zhì)譜(LC-MS-MS)等。但這還僅僅只是限于實(shí)驗(yàn)室研究階段,在實(shí)踐中直接利用的效果并不理想,其活性物質(zhì)的分離純化困難且收集率低,這使得生物菌劑投產(chǎn)與使用都難以實(shí)現(xiàn)。

      采用三維熒光技術(shù)對(duì)藻膽蛋白的測(cè)定來(lái)表征溶藻效果,借助三維熒光光譜解析溶藻降解產(chǎn)物;通過(guò)對(duì)菌液進(jìn)行熱處置、破碎處置、酸堿處置、透析處置等手段研究了菌株R1 Lysinibacillus macroides的溶藻機(jī)理;并通過(guò)HPLC技術(shù)初步分離提取了有效溶藻物質(zhì)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 藻種來(lái)源:銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所。

      菌種來(lái)源:從太湖激浪魚(yú)內(nèi)臟(魚(yú)鰓、魚(yú)腸等)中篩選出了1株溶藻效果較佳的菌株R1,培養(yǎng)2 d后,菌落呈圓形,直徑大約1~2 mm,白色,表面光滑,微微凸起,邊緣光滑,生長(zhǎng)快速;革蘭氏染色呈紫色,為陽(yáng)性菌(如圖1),經(jīng)生理生化及16S rDNA序列分析,其與Lysinibacillusmacroides相似性最高,達(dá)99.50%。

      圖1 R1革蘭氏染色

      1.1.2 主要儀器和試劑 1)試劑:試劑均為中國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

      2)儀器:離心機(jī)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、倒置顯微鏡、島津紫外分光光度計(jì)UV-1800、Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)等。

      1.1.3 培養(yǎng)基及其他試劑 LB培養(yǎng)基[14]、銅綠微囊藻培養(yǎng)基BG-11[15]

      1.2 方法

      1.2.1 菌株溶藻能力考察 為探索菌株R1的溶藻效果,取10 mL培養(yǎng)24 h的R1菌液接種到100 mL銅綠微囊藻溶液中(初始chl-a含量為205.11 mg/L),27 ℃、光暗比12 h∶12 h周期下培養(yǎng),每天定期手動(dòng)搖晃2~3次,每隔2 d測(cè)得chl-a含量變化,通過(guò)式(1)[16]計(jì)算溶藻率并繪制曲線,同時(shí)做空白對(duì)照。

      η=(Cc-Ct)/Cc×100%

      (1)

      式中:η為溶藻率,%;Cc為初始chl-a含量,mg/L;Ct為后期chl-a含量,mg/L。

      1.2.2 三維熒光考察溶藻效果 通過(guò)測(cè)定chl-a含量的方法考察溶藻效果較為繁瑣,測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng),且需要耗費(fèi)許多提取物;使用顯微鏡觀察藻細(xì)胞形態(tài)數(shù)量是最傳統(tǒng)的浮游藻類(lèi)分析方法,該方法工作量大,比較繁瑣,且有時(shí)辨別不清[17]。銅綠微囊藻有很強(qiáng)的熒光特性的藻膽蛋白,是一種卟啉類(lèi)色素蛋白,卟啉具有π電子結(jié)構(gòu)[9],在特定的波長(zhǎng)照射下有很強(qiáng)的熒光反應(yīng)。熒光光譜分析方法快速、準(zhǔn)確、樣品不需要特別處置、簡(jiǎn)單高效。銅綠微囊藻細(xì)胞具有如下熒光特性:藻密度與發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)關(guān)[18],在低濃度下,熒光強(qiáng)度與溶液濃度成正比,可進(jìn)行定量分析[18-20]。

      為表征菌株溶藻過(guò)程,對(duì)菌藻混合液(參照1.2.1)進(jìn)行了三維熒光譜圖分析,取菌藻混合液,進(jìn)行三維熒光掃描,發(fā)射波長(zhǎng)(簡(jiǎn)稱Em)280~900 nm/280~550 nm,激發(fā)波長(zhǎng)(簡(jiǎn)稱Ex)220~800 nm/220~400 nm;狹縫寬度為5 nm;

      每隔一段時(shí)間收集混合液測(cè)Em為650 nm的三維熒光光譜,通過(guò)式(2)[21]計(jì)算溶藻率并繪制曲線。

      η=(Fc-Ft)/Fc×100%

      (2)

      式中:η為溶藻率,%;Fc為藻膽蛋白初始光強(qiáng),A.U;Ft為后期藻膽蛋白的光強(qiáng),A.U。

      1.2.3 三維熒光圖譜EMMs結(jié)合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物 為表征菌株溶藻產(chǎn)物,對(duì)降解后的藻液進(jìn)行了三維熒光譜圖分析,發(fā)射波長(zhǎng)(簡(jiǎn)稱Em)280~550 nm,狹縫寬度為2 nm;激發(fā)波長(zhǎng)(簡(jiǎn)稱Ex)220~400 nm;狹縫寬度為5 nm;同時(shí),考察純?cè)逡杭捌渚旱臒晒馓匦?。EEMs分析物質(zhì)鑒定,主要采用目視鑒定,無(wú)法避免光譜重疊帶來(lái)的誤差且具有主觀性。采用三維熒光圖譜結(jié)合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物:1)數(shù)據(jù)預(yù)處理:并用Delauay三角形內(nèi)插值法瑞利散射及拉曼散射。2)平行因子分析:平行因子算法是基于三線性分解理論,采用交替最小二乘原理,進(jìn)行迭代的三維數(shù)陣分解算法??梢詫⒁粋€(gè)由多個(gè)三維熒光光譜矩陣分解為3個(gè)方向的載荷矩陣。通過(guò)對(duì)半檢驗(yàn)法(split-half analysis),殘差平方和的最小,及核一致性檢驗(yàn)來(lái)確定模型的有效性。采用MATLAB軟件中的Nway toolbox運(yùn)行[22-24]。

      1.2.4 菌株的溶藻特性 為探討溶藻細(xì)菌的溶藻機(jī)制,將培養(yǎng)24 h溶藻細(xì)菌R1培養(yǎng)液進(jìn)行如下處理:

      1)離心過(guò)濾上清液(8 000 r/min,10 min;過(guò)0.22 μm濾膜)、高熱處理上清液(121 ℃,20 min)、菌體破碎液(取離心后的菌體沉淀超聲波破碎)[16]。

      2)酸堿化處置[12]:為考察pH對(duì)溶藻物質(zhì)活性的影響,分別調(diào)節(jié)菌液pH為4、7、10,處置1 h后調(diào)回中性,同時(shí)做不加菌的空白對(duì)照,接菌量為10%(體積),采用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板(biologix 24孔板)進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn),并采用顯微鏡計(jì)數(shù)法檢查溶藻效果。

      3)截留分子量[12]:為考察溶藻活性物質(zhì)的分子大小,分別采用截留分子量為100、500、1 000 da的透析袋對(duì)培養(yǎng)24 h后的菌液進(jìn)行透析1 d,取透析袋中截留液于裝載銅綠微囊藻溶液的24孔板中,檢查溶藻效果。

      1.2.5 溶藻活性物質(zhì)的純化與分離[13]

      1)菌液前處理:接種菌株R1至500 mL的LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃、135 r/min,培養(yǎng)24 h;采用0.45 um的濾膜過(guò)濾;收集菌液并加入4倍體積的乙醇進(jìn)行萃取,磁力攪拌30 min,后靜置2 h;使用0.22 um的濾膜過(guò)濾;收集菌液60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā);無(wú)菌水重溶,4 ℃保存。

      2)HPLC:通過(guò)液相色譜初步確定可能性溶藻物質(zhì)。色譜條件為:色譜柱wonda sil C18(4.6×250 mm),流動(dòng)相A(甲醇)∶B(1%乙酸)為1∶9,檢測(cè)波長(zhǎng)為UV200 nm。

      3)為考察這幾個(gè)物質(zhì)是否含有溶藻活性物質(zhì),每隔一段時(shí)間收集1餾分,氮?dú)獯蹈?,超純水重溶,并采?4孔板進(jìn)行溶藻效果檢驗(yàn)。對(duì)有溶藻活性的收集液,再次使用HPLC檢查其純度及其峰值。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 菌株R1的溶藻能力

      將R1菌液到銅綠微囊藻溶液中(初始chl-a為205.11 mg/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過(guò)肉眼觀察顏色變化及chl-a含量測(cè)定檢驗(yàn)溶藻效果,如圖2。實(shí)驗(yàn)4 d后,肉眼可見(jiàn)混合液發(fā)生黃化現(xiàn)象,chl-a含量不斷減少,10 d后剩余chl-a含量?jī)H為35.61 mg/L,降解率達(dá)82.64%;同時(shí)觀察到空白樣顏色更加深綠,經(jīng)測(cè)定chl-a含量,從初始205.11 mg/L增長(zhǎng)到324.56 mg/L。

      圖2 溶藻細(xì)菌R1對(duì)chl-a含量的影響Fig.2 Effects of R1 on chlorophyll

      2.2 三維熒光分析R1溶藻能力

      取0、3、7、10、12 d的菌藻混合液進(jìn)行三維熒光光譜掃描并分析,如圖3。溶藻過(guò)程中藻膽蛋白熒光峰Em/Ex為650 nm/630 nm,熒光光強(qiáng)不斷減少。為表征其溶藻效果,通過(guò)固定Em為650 nm,將得到的熒光光譜減去去離子水的熒光光譜以去除瑞利散射的影響,將瑞利散射峰置零[18],采用oringin8.6擬合得到光強(qiáng)與激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系圖,如圖4。按照式2)計(jì)算,10 d溶藻率為達(dá)89.80%,與通過(guò)chl-a表征的溶藻率82.64%相近,可作為溶藻細(xì)菌溶藻效率的一種評(píng)價(jià)方法。

      圖3 菌藻液的三維熒光圖Fig.3 Three-dimensional fluorescence of

      圖4 Em 650 nm的激發(fā)光譜及溶藻效果圖Fig.4 The excitation spectra at the transmitting wavelength of 650 nm and Dissolving rate of

      2.3 菌株R1溶藻機(jī)制研究

      1)由表1及圖5(1)看出:R1菌原液、離心上清液、高溫滅菌液都發(fā)生了明顯的黃化現(xiàn)象,溶藻效果顯著;菌體破碎液及菌體沒(méi)有溶藻效果;可見(jiàn),其溶藻物質(zhì)并不是胞內(nèi)物質(zhì),也不是菌株本身,而是細(xì)菌分泌的胞外物質(zhì),具有耐高溫的特性,推測(cè)為非蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)。

      2)由表2及圖5(2)看出,經(jīng)過(guò)不同處置的R1菌液都具有很強(qiáng)的溶藻效果,與空白對(duì)比,藻液均發(fā)生明顯的黃化現(xiàn)象;顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2,從表中可見(jiàn),藻細(xì)胞數(shù)量都明顯減少,由此可見(jiàn),溶藻活性物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定,具有耐酸耐堿性。

      3)經(jīng)100、500、1 000 da的透析袋截留分子量后袋中截留液,顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3,發(fā)現(xiàn)溶藻能力強(qiáng)弱順序依次為100 da>500 da>1 000 da,其中,1 000 da溶藻活性很低,由此可見(jiàn),細(xì)菌分泌的有效溶藻物質(zhì)為小分子物質(zhì),分子量小于500 da。

      表1 不同菌體處理方式對(duì)溶藻效果的影響Table 1 Effect of different gloop treatment methods on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

      表2 不同pH處置方式對(duì)溶藻效果的影響Table 2 Effect of different pH disposal methods on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

      表3 不同截留分子量對(duì)溶藻效果影響Table 3 Effect of different molecular weight on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

      圖5 R1菌液經(jīng)不同處理對(duì)溶藻的效果影響Fig.5 The algae-lysing efficiency of R1 bacteria solution

      2.4 三維熒光圖譜結(jié)合平行因子模型分析R1溶藻產(chǎn)物

      菌株R1溶藻過(guò)程中,Em/Ex為400~600 nm/250~450 nm處出現(xiàn)了大面積的熒光反應(yīng),熒光光譜不成規(guī)則的圓形,成分復(fù)雜,如圖3。分別對(duì)銅綠微囊藻分泌物、菌液及其降解后的菌藻共培液液進(jìn)行三維熒光光譜掃描,三維矩陣圖譜見(jiàn)圖6,分別為藻細(xì)胞產(chǎn)生的溶解性代謝性產(chǎn)物(EOM)(Em/Ex 335 nm/280 nm)、R1菌液的主要溶解性熒光組分(Em/Ex 335 nm/280 nm、Em/Ex 435~475 nm/350~380 nm、Em/Ex 475 nm/280 nm)及溶藻產(chǎn)物組分(Em/Ex 335 nm/280 nm、 Em/Ex 335 nm/230 nm)。

      圖6 菌藻混合液的三維熒光光譜EMMsFig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of algal

      運(yùn)用PARAFAC模型結(jié)合EMMs圖譜對(duì)溶藻產(chǎn)物的三維熒光矩陣進(jìn)行解析,并通過(guò)殘差和最小分析法及裂半分析法,識(shí)別出溶藻混合液共含有可分為2個(gè)類(lèi)型。分別為:475 nm/250~350 nm;330 nm/220~270 nm,對(duì)應(yīng)及類(lèi)色氨酸類(lèi)物質(zhì)[22-24]。這2個(gè)成分的熒光圖譜及激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)載荷見(jiàn)圖7。從圖中可見(jiàn),2個(gè)熒光成分的激發(fā)載荷圖譜具有2個(gè)激發(fā)峰和1個(gè)發(fā)射峰,主要體現(xiàn)了長(zhǎng)波類(lèi)腐殖質(zhì)及色氨酸物,分析其溶藻過(guò)程中,長(zhǎng)波類(lèi)類(lèi)色氨酸類(lèi)物質(zhì)增加,為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測(cè)出,藻細(xì)胞死亡后,胞內(nèi)的物質(zhì)及細(xì)胞組分大量釋放到混合液中。長(zhǎng)波類(lèi)類(lèi)腐殖酸減少,根據(jù)其化學(xué)形成原理(由-COOH、-OH基團(tuán)的有機(jī)化合物合成的結(jié)果),其中可能含有迫使藻死亡的有效成分,結(jié)合其分子量及極性特征猜測(cè)可能為小分子的疏水性氨基酸(hydrophbic acid)。

      圖7 PARAPC分析溶藻組分及其激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)載荷Fig.7 Fluorescence components identified by the PARAFAC model and their excitation and emission wavelengths

      2.5 溶藻活性物質(zhì)的分離與純化

      圖8 粗提液的HPLC-200 nm掃描圖Fig.8 HPLC-200 nm scan of crude

      溶藻活性物質(zhì)的分離難度大,目前溶藻物質(zhì)的分離純化的報(bào)道目前還很少。本研究通過(guò)采用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)分離提純粗提液,掃描波長(zhǎng)200 nm的色譜圖,見(jiàn)圖8。圖中具有多個(gè)物質(zhì)峰,可見(jiàn)經(jīng)前處理的菌液成分仍很復(fù)雜。每分鐘收集1餾分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),超純水重溶,并采用24孔板進(jìn)行溶藻效果檢驗(yàn)。其中有1餾分具有溶藻效果,見(jiàn)如9,其在既定條件下有個(gè)主要峰,保留時(shí)間分別為6.005。結(jié)合熒光光譜分析,結(jié)合熒光光譜分析,其屬于某種疏水性酸類(lèi)。由于HPLC分離效率低,分離量極少而且成本很高,分離的餾分中仍還有其他成分,其溶藻物質(zhì)仍需進(jìn)一步分離及鑒定。

      圖9 溶藻活性物的HPLC-200 nm掃描圖Fig.9 The HPLC-200 nm scan of the lytic active

      3 結(jié)論

      1)從太湖土著激蕩魚(yú)內(nèi)臟中篩選的R1菌(Lysinibacillusmacroides),以銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)為受試對(duì)象,10 d內(nèi)chl-a含量從205.11 mg/L降至35.61 mg/L,溶藻率達(dá)82.64%。高溫處置、酸堿處置、透析處置手段確定R1菌通過(guò)分泌耐高溫的非蛋白類(lèi)物質(zhì)溶藻,屬于間接溶藻,且該物質(zhì)具有耐酸耐堿性,其分子量小于500 da。

      2)熒光光譜能夠很好的表征銅綠微囊藻含量的變化,其熒光物質(zhì)為藻膽蛋白。溶藻過(guò)程中其強(qiáng)度不斷減少,可見(jiàn)藻細(xì)胞不斷被破壞,數(shù)量被不斷減少。固定Em為650 nm,通過(guò)熒光激發(fā)光譜圖對(duì)藻細(xì)胞密度進(jìn)行定量分析。通過(guò)熒光光強(qiáng)表征溶藻效果,避免了傳統(tǒng)藻類(lèi)測(cè)量過(guò)程的繁瑣,具有重要意義。熒光光譜分析表明溶藻活性物質(zhì)可能為疏水性酸。溶藻過(guò)程中,長(zhǎng)波類(lèi)類(lèi)色氨酸類(lèi)物質(zhì)增加,為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測(cè)出,藻細(xì)胞死亡后,胞內(nèi)的物質(zhì)及細(xì)胞組分大量釋放到混合液中。長(zhǎng)波類(lèi)類(lèi)腐殖酸減少,根據(jù)其成分(含有-COOH、-OH基團(tuán)的有機(jī)化合物)猜測(cè),其中可能含有迫使藻死亡的有效成分,可能為某種疏水性氨基酸(hydrophbic acid)。

      3)采用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)分離提純粗提液(掃描波長(zhǎng)200 nm),分離結(jié)果表明,從R1粗提液中分離出的1餾分溶藻活性物質(zhì),其在既定條件下其出峰時(shí)間為6~8 min左右,推測(cè)其為某種酸類(lèi)物質(zhì),但這需要進(jìn)一步的分離和鑒定。

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