接種不同ERM菌株的桃葉杜鵑苗對(duì)持續(xù)干旱后復(fù)水的生理響應(yīng)

王麗娟 ，歐 靜 ，蔡衛(wèi)東

（1.黔南州林業(yè)科學(xué)研究所，貴州 都勻 558000；2.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽 550025）

桃葉杜鵑(Rhododendron annae Franch.)是杜鵑花科杜鵑花屬常綠灌木，花色豐富，花期在5-6月份少花季節(jié)，具有較高的觀賞價(jià)值[1]，是杜鵑花中晚花種類[2]，但由于其遺傳因子的限制性，喜冷涼濕潤(rùn)環(huán)境，目前絕大部分仍處于野生狀態(tài)。在當(dāng)今水資源越來越少的情況下，想要把較高觀賞價(jià)值的野生高山常綠桃葉杜鵑引種馴化到城市綠化樹種中，需要其具有較強(qiáng)的耐干旱能力。

國(guó)外相關(guān)研究證明[3-5]，杜鵑花科植物之所以能在全球廣泛分布，而且大多生境條件很惡劣，這與杜鵑類植物共生真菌有著舉足輕重的關(guān)系，杜鵑花類菌根(Ericoid mycorrhizas，ERM)能促進(jìn)其宿主植物的營(yíng)養(yǎng)吸收，且能增強(qiáng)宿主植物對(duì)逆境環(huán)境的適應(yīng)性。ERM的研究在我國(guó)越來越受到重視，有大量關(guān)于ERM菌株調(diào)查、分離及促生作用的研究報(bào)道[6-13]。歐靜[14]的研究也表明：ERM菌株能增強(qiáng)桃葉杜鵑對(duì)N、P元素的吸收，促進(jìn)其生長(zhǎng)。相關(guān)研究已證明[15-16]，不同梯度的干旱脅迫下，ERM菌株能顯著提高桃葉杜鵑的光和效應(yīng)及生理效應(yīng)，增強(qiáng)其抗干旱能力，但持續(xù)干旱后復(fù)水ERM菌株是否能恢復(fù)桃葉杜鵑正常生長(zhǎng)的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)接種4種ERM菌株的桃葉杜鵑進(jìn)行持續(xù)干旱后復(fù)水，研究在持續(xù)干旱一段時(shí)間后復(fù)水不同ERM菌株對(duì)桃葉杜鵑生理生化指標(biāo)的影響，旨在篩選出具有較強(qiáng)抗旱和恢復(fù)能力的ERM菌株，為桃葉杜鵑野生資源在遷地保育及引種馴化的抗旱性方面提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4個(gè)供試菌株編號(hào)為TY02(AJ279484：Ascmycete sp.)，TY21(AB369417：Cryptosporiopsis ericae)，TY29(AB158314:Trametes ochracea），TY35 (AB378554:Pochonia bulbillosa)(括號(hào)中前者為國(guó)際GenBank中的登錄號(hào)，后者為與試驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近種)均是培育桃葉杜鵑菌根苗優(yōu)良備選菌株[17]，保存于5℃冰箱中，對(duì)照為不接菌（CK)。試驗(yàn)苗為桃葉杜鵑，育苗所用種子采自貴州省百里杜鵑風(fēng)景區(qū)方家坪景區(qū)，位于東經(jīng) 105°53′30″， 北緯 27°14′51″， 海拔 1800-1830m，土壤pH4.5～5.0，幾乎全為成年開花桃葉杜鵑純林。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取各處理生長(zhǎng)一致的1年生桃葉杜鵑菌根苗移栽至花盆中，統(tǒng)一澆水管理至其全部正常后開始水分脅迫試驗(yàn)，開始干旱脅迫之前，使每盆的土壤含水量均達(dá)到飽和狀態(tài)，置于溫室大棚內(nèi)模擬自然干旱，使水分不斷消耗。采取隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)4個(gè)接種處理，1個(gè)對(duì)照，每處理10盆，每盆1株，每處理重復(fù)3次，共150盆。分別在持續(xù)干旱當(dāng)天(0d)和持續(xù)干旱的第5d、10d、15d對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)在干旱脅迫的第15d對(duì)苗進(jìn)行復(fù)水，并在復(fù)水后第5d進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

菌根侵染率采用采用酸性品紅染色鏡檢法。苗高、地徑利用卷尺和游標(biāo)卡尺進(jìn)行苗高 （精確到0.1cm）、地徑（精確到0.01mm）的定點(diǎn)測(cè)量。可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定，游離脯氨酸采用酸性茚三酮顯色法測(cè)定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，SOD活性采用氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定，CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定。RWC(%)=[(葉片鮮重—葉片干重）/（葉片飽和鮮重—葉片干重）]×100%，WSD （%）=（1-RWC）×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Execl2010記錄數(shù)據(jù)及繪圖，使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncan多重比較法（0.05和0.01水平）分析不同菌根苗在同一水分梯度下以及同一菌根苗在不同水分梯度下的形態(tài)和生理指標(biāo)進(jìn)行方差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 持續(xù)干旱后復(fù)水不同ERM菌株對(duì)桃葉杜鵑生長(zhǎng)的影響

接種不同ERM菌株對(duì)桃葉杜鵑根系親和力的差異性，反映出宿主對(duì)不同菌株的依賴性程度不同，接種苗的菌根依賴性均大于100%，接種不同ERM菌株對(duì)桃葉杜鵑菌根侵染率呈極顯著差異(p<0.01)，菌根侵染率達(dá)到36.8%～57.6%，菌根貢獻(xiàn)率為16.8%～55.9%。

圖1 不同菌株接種桃葉杜鵑播種苗的侵染率、依賴性和菌根貢獻(xiàn)率Fig.1 Mycorrhizal colonsation,Mycorrhizal dependency and Mycorrhizal contribution rate of different strains inoculation of Rhododendron annae sowing seedings

接種ERM菌株能顯著促進(jìn)桃葉杜鵑苗木的生長(zhǎng)(p＜0.05)，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，苗高地徑呈不同幅度的增大，但在脅迫第10d后CK苗高幾乎不變，直到復(fù)水后再測(cè)量其變化也不明顯。除接種TY35號(hào)菌株的苗木外，其余各處理的地徑隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高-降低趨勢(shì)，但菌根苗均大于CK苗，在第10d時(shí)達(dá)到最大。

2.2 持續(xù)干旱后復(fù)水不同ERM菌株對(duì)桃葉杜鵑苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸）在水分脅迫下，可提高細(xì)胞液濃度，降低滲透勢(shì)，提高細(xì)胞吸水或保水能力，從而適應(yīng)水分脅迫環(huán)境。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，苗木可溶性糖含量呈上升—降低的變化趨勢(shì)，在第10d時(shí)達(dá)到最大，其中以接種TY35的苗木可溶性糖最高，較CK增加了125.15%。脅迫第15d時(shí)，各苗木可溶性糖和可溶性蛋白含量均降低，復(fù)水后，菌根苗可溶性糖含量和可溶性蛋白較之前不同程度的增加，但CK苗可溶性糖含量則降低，說明，ERM菌株能增強(qiáng)桃葉杜鵑幼苗在干旱復(fù)水后的補(bǔ)償效應(yīng)，從而增強(qiáng)苗木的耐干旱能力。

而隨著干旱脅迫持續(xù)延長(zhǎng)，苗木游離Pro含量呈逐漸上升趨勢(shì)，前10d的脅迫中，未接菌的苗木游離Pro含量顯著高于菌根苗的，在脅迫第15d時(shí)，CK苗游離Pro含量呈顯著下降趨勢(shì)，而菌根苗含量仍持續(xù)增加。說明，持續(xù)干旱第15d時(shí)，CK苗受到嚴(yán)重的干旱威脅，已不能適應(yīng)干旱的土壤條件。復(fù)水5d后，菌根苗游離Pro含量呈大幅度下降趨勢(shì)，降幅大小依次為：TY35(56.4%)＞TY29(48.9)＞TY21(42.7%)＞TY02(34.3%)，與正常水分條件下的含量相差不大，但CK苗游離Pro含量仍顯著高于正常水分條件下的。說明：接種ERM菌株的苗木在干旱過程中，可減輕干旱脅迫條件下苗木對(duì)土壤水分虧缺程度，降低葉片中Pro含量，從而減緩了桃葉杜鵑幼苗遭受脅迫的程度，有一定的補(bǔ)償效應(yīng)，提高了苗木的耐旱能力，且不同菌株表現(xiàn)效果不同，以接種TY29和TY35號(hào)菌株效果較好。

2.3 持續(xù)干旱后復(fù)水不同ERM菌株對(duì)桃葉杜鵑苗丙二醛和抗氧化系統(tǒng)的影響

丙二醛(MDA)是植株膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，常作為膜脂過氧化反應(yīng)的程度評(píng)價(jià)指標(biāo)，其含量越高，證明植物組織受到逆境傷害越嚴(yán)重，植物抗逆性就越弱。持續(xù)干旱脅迫下，苗木MDA含量呈逐漸升高趨勢(shì)，各處理間差異顯著，脅迫第5d時(shí)CK苗顯著高于0d時(shí)的，第10d和第15d時(shí)，土壤水分持續(xù)散失至過低，無法滿足植物生長(zhǎng)需求，苗木受到干旱的威脅，膜脂過氧化嚴(yán)重引起MDA含量的累積，但同一脅迫時(shí)間里菌根苗MDA含量顯著低于CK苗(p<0.05)(圖4)，證明接種ERM菌株后能顯著降低桃葉杜鵑苗MDA含量，減輕細(xì)胞膜脂過氧化的傷害，從而緩解干旱造成的危害。干旱15d后復(fù)水，苗木MDA含量均得到明顯降低，菌根苗與CK間差異極顯著 (p<0.01)，表明在受到干旱脅迫15d時(shí)苗木質(zhì)膜系統(tǒng)的損傷是可恢復(fù)的，且菌根苗恢復(fù)效果更好，以接種TY35苗木降幅最大為74.64%。

表1 持續(xù)干旱后復(fù)水對(duì)不同桃葉杜鵑菌根苗苗高和地徑的變化Tab.1 Change of diameters and heights to different Rhododendron annae mycorrhizal seedlings under the condition of progressive drying and rewatering

圖2 持續(xù)干旱后復(fù)水對(duì)不同桃葉杜鵑菌根苗可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量的影響Fig.2 Effects of soluble sugar,solubility protein and freeproline content to different Rhododendron annaemycorrhizal seedlings under the condition of progressivedrying and rewatering

圖3 持續(xù)干旱后復(fù)水對(duì)不同桃葉杜鵑菌根苗MDA含量的影響Fig.3 Effects of MDA to different Rhododendron annaemycorrhizal seedlings under the condition of progressivedrying and rewatering

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶 (CAT)是植物體內(nèi)膜系統(tǒng)的三大保護(hù)酶，其活性的變化是測(cè)定植物抗逆性強(qiáng)弱的主要指標(biāo)。隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)于CK苗，菌根苗SOD、POD、CAT活性呈顯著升高趨勢(shì)(p<0.05)，在試驗(yàn)第10d時(shí)達(dá)到最大值，以接種TY35的苗木含量最高。說明，接種ERM菌株的桃葉杜鵑苗在一定時(shí)間的干旱脅迫下，能顯著提高葉片中SOD、POD、CAT酶活性，保護(hù)其葉片不受氧化傷害。但在脅迫第15d時(shí)，各保護(hù)酶含量急劇降低，可能是苗木保護(hù)膜受到嚴(yán)重的損傷而喪失其保護(hù)功能，致使保護(hù)酶活性降低。解除干旱脅迫后，菌根苗保護(hù)酶活性呈不同程度的升高，但CK苗木保護(hù)酶活性仍呈持續(xù)降低趨勢(shì)。

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫對(duì)植物最直觀的影響是生長(zhǎng)形態(tài)，本研究中，持續(xù)干旱抑制了苗木生長(zhǎng)，但持續(xù)干旱的同一時(shí)間內(nèi)，桃葉杜鵑菌根苗的苗高和地徑均高于CK苗，可能是因?yàn)樵谕寥廊彼疇顩r下，菌絲通過擴(kuò)大根與土壤的接觸面積來增加寄主的根際范圍，改善苗木對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，利于植株更好地利用和保持土壤水分，從而增強(qiáng)其抗旱性。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片中參與滲透調(diào)節(jié)的可溶性糖及游離Pro含量增加，以提高細(xì)胞的保水能力，且菌根苗的增加比CK苗顯著，這與催秀敏等[19-21]研究結(jié)果相似，表明接種ERM菌株能改善桃葉杜鵑幼苗水分代謝，有效減輕其受干旱脅迫程度；MDA含量持續(xù)增加，說明膜脂過氧化反應(yīng)持續(xù)加重，同時(shí)誘導(dǎo)苗木葉片中SOD、POD、CAT保護(hù)酶活性顯著增加，而菌根苗MDA含量始終低于CK苗，保護(hù)酶活性高于CK苗，表明，在相同的干旱條件下，桃葉杜鵑菌根苗細(xì)胞內(nèi)較強(qiáng)的保水能力能緩沖干旱造成細(xì)胞脫水而引起的膜系統(tǒng)損失，從而提高苗木抗旱性。復(fù)水后，干旱脅迫解除，菌根苗MDA含量比CK苗下降速度快，而酶活性的增加均比CK苗快，這一結(jié)果表明接種ERM菌株不僅能提高桃葉杜鵑抗旱能力，且增強(qiáng)了其氧化脅迫后的修復(fù)能力。

圖4 持續(xù)干旱后復(fù)水對(duì)不同桃葉杜鵑菌根苗SOD、POD和CAT含量的影響Fig.4 Effects of SOD,POD and CAT content to differentRhododendron annae mycorrhizal seedlings under thecondition of progressive drying and rewater

持續(xù)干旱脅迫后復(fù)水，ERM菌株能有效調(diào)節(jié)滲透調(diào)劑物質(zhì)、抗氧化酶系統(tǒng)、MDA含量來提高桃葉杜鵑苗的抗旱能力及受旱后的恢復(fù)能力，不同ERM菌株修復(fù)能力存在差異，這可能跟菌株與桃葉杜鵑的親和力有關(guān)，本研究中以接種TY29和TY35號(hào)菌株的桃葉杜鵑苗對(duì)持續(xù)干旱后復(fù)水的恢復(fù)能力較好，但具體的調(diào)控方式有待進(jìn)一步的研究。