郭亞蕓， 丁 燕， 韓曉梅， 王 哲， 史紅梅

(山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南 250100)

三唑類殺菌劑是一類含有1,2,4-三唑環(huán)的含氮雜環(huán)類有機(jī)化合物，它對植物具有抑菌和調(diào)節(jié)生理效能的作用。但是，此類農(nóng)藥可以擾亂人體內(nèi)分泌，且對人體具有致癌、致突變作用[1]。三唑類殺菌劑通常用來預(yù)防和治療葡萄白腐病、炭疽病和白粉病，目前常使用的有戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑四種典型農(nóng)藥。然而該類殺菌劑多屬于內(nèi)吸性殺菌劑，殘留在葡萄中會(huì)通過發(fā)酵進(jìn)入葡萄酒[2]。因此，三唑類殺菌劑在葡萄酒中的殘留檢測日益受到重視。

目前，三唑類農(nóng)藥檢測常采用的方法有高效液相色譜/質(zhì)譜法[3 - 4]、氣相色譜/質(zhì)譜法[5]及氣相色譜法[6]等。但在實(shí)際樣品檢測中，葡萄酒基質(zhì)成分復(fù)雜、干擾物質(zhì)多且農(nóng)藥殘留量低，因此需要采用可靠的樣品前處理技術(shù)。而分散液液微萃取(DLLME)技術(shù)已經(jīng)在葡萄酒中生物胺[7]、有機(jī)氯農(nóng)藥[8]、擬除蟲菊酯[9]、鹵代酚和鹵代苯甲醚[10]等分析中成功應(yīng)用。

本文以4種典型的三唑類農(nóng)藥戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑?yàn)檠芯繉ο?，采用超聲輔助-分散液液微萃取(UA-DLLME)技術(shù)對樣品進(jìn)行前處理，然后采用氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)法分離測定，為葡萄酒中上述三唑類農(nóng)藥殘留檢測提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津GC/MS-QP2010 Ultra及工作站(日本，島津公司)；80-2離心機(jī)(上海浦東物理光學(xué)儀器廠)；KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；雷磁pH計(jì)(儀電科學(xué)儀器)。

標(biāo)準(zhǔn)品：戊菌唑(98%)(西亞試劑有限公司)；氟硅唑(99.8%)、烯唑醇(99.5%)、苯醚甲環(huán)唑(98%)(阿拉丁試劑有限公司)；NaCl、十一醇、正十六烷、正癸醇、乙醇、DL-酒石酸、NaOH，均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

葡萄酒(1#、2#、3#、4#、5#)均購于濟(jì)南某大型超市。

1.2 GC/MS測定條件

GC條件：RXi-5ms毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣：高純氦氣，采用分流進(jìn)樣，分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度 290 ℃，柱溫采用程序升溫:55 ℃以30 ℃·min-1升至200 ℃，再以3 ℃·min-1升至250 ℃，最后以15 ℃·min-1升至290 ℃并保持5 min，恒流模式，流量：1.0 mL·min-1。

MS條件：傳輸線溫度：230 ℃，離子源溫度：230 ℃，電離模式：電子轟擊源(EI)，轟擊能量：70 eV，選擇離子監(jiān)測(SIM)模式檢測。農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子和定性離子見表1。

表1 選擇離子監(jiān)測三唑類殺菌劑的保留時(shí)間、定量離子和定性離子

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和模擬酒樣的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，配制成濃度均為1.00 g·L-1的4種三唑類標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏保存。模擬酒樣：配制體積分?jǐn)?shù)為12% 的乙醇溶液，加入適量酒石酸，調(diào)節(jié)pH為3.5。

1.4 分散液液微萃取實(shí)驗(yàn)步驟

在10 mL具塞尖底玻璃離心管中，加入2.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液或葡萄酒，再加入2.5 mL超純水，然后加入0.15 g NaCl振蕩使其溶解，再加入30 μL十一醇作為萃取劑，振蕩后放入超聲儀中超聲10 min，再以3 500 r·min-1離心15 min，十一醇在液面成漂浮液珠，冰浴50 min，液珠凝固，迅速取出凝固狀十一醇，待十一醇溶化，用微量進(jìn)樣器取1 μL進(jìn)行GC/MS分析。

2 結(jié)果與討論

為確定最優(yōu)的萃取條件，本文利用目標(biāo)分析物的色譜峰面積評價(jià)其萃取效率[11]。

2.1 分散液液微萃取條件優(yōu)化

2.1.1萃取劑的選擇選擇合適的萃取劑是提高萃取效率的關(guān)鍵，本文分別試驗(yàn)了凝固點(diǎn)在室溫附近的正癸醇(m.p.6 ℃)、十一醇(m.p.11 ℃)和正十六烷(m.p.18 ℃)，考察它們的萃取特性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：正癸醇凝固點(diǎn)偏低，冰浴后分離取出時(shí)易熔化損失；正十六烷疏水性太強(qiáng)，萃取過程中不易形成乳濁液。因此，本文選擇十一醇作為萃取劑。

2.1.2萃取劑體積的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分別取20、30、40、50、60 μL十一醇作為萃取劑，考察目標(biāo)分析物的萃取效率。結(jié)果表明，當(dāng)十一醇的體積為30 μL時(shí)，戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑的色譜峰面積均達(dá)到最大值，即萃取效率達(dá)到最大值。原因是萃取劑體積較小時(shí)，分析物難以完全進(jìn)入有機(jī)相；體積過大則降低了有機(jī)相中目標(biāo)分析物的濃度[11]。實(shí)驗(yàn)選擇十一醇的體積為30 μL。

2.1.3超聲時(shí)間的選擇由于本實(shí)驗(yàn)的基質(zhì)為體積分?jǐn)?shù)為12% 的乙醇溶液，乙醇起到了輔助乳化的作用，而超聲可以提供足夠的能量使萃取劑較好的分散在基質(zhì)中，因此本實(shí)驗(yàn)不使用分散劑，目標(biāo)分析物也獲得了良好的萃取效果[12]。改變超聲時(shí)間，分別為1、5、10、15、20 min，考察對目標(biāo)分析物萃取效率的影響。結(jié)果表明：超聲10 min時(shí)，戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑的萃取效率最高，超聲時(shí)間短，萃取不完全，超聲時(shí)間過長，機(jī)體溫度升高，試劑的揮發(fā)程度增大，萃取效率降低[14]。實(shí)驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為10 min。

2.1.4鹽濃度對萃取效率的影響添加NaCl有利于目標(biāo)分析物由水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相[14]。實(shí)驗(yàn)考察了NaCl濃度為0～50 g·L-1時(shí)，戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑的萃取效率。結(jié)果表明：當(dāng)NaCl的質(zhì)量濃度為30 g·L-1時(shí)，戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑的萃取效率達(dá)到最大，繼續(xù)增加NaCl濃度，萃取效率逐漸降低。因此，確定NaCl的最佳濃度為30 g·L-1。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限配制一系列濃度為0.001～0.5 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加到模擬酒樣中，按照1.4節(jié)的方法進(jìn)行測定，質(zhì)譜掃描方式為SIM模式，定性和定量離子的選擇由表1所示。以添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的模擬酒樣中目標(biāo)分析物的濃度(x,mg·L-1)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)SIM掃描定量離子色譜峰峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸計(jì)算，如表2所示。戊菌唑、氟硅唑和烯唑醇濃度在0.001～0.5 mg·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，苯醚甲環(huán)唑濃度在0.001～0.2 mg·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.9999、0.9997、0.9999和0.9995。以3倍信噪比(S/N)計(jì)算，得到以上4種三唑類殺菌劑的檢出限在0.019～0.039 μg·L-1之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑的平均富集倍數(shù)分別為 61.7、71.3、83.9和115.6倍(表2)。

表2 三唑類殺菌劑的線性方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和富集倍數(shù)

2.2.2方法準(zhǔn)確度與精密度為考察該方法的可行性和用于葡萄酒測定時(shí)的準(zhǔn)確度與精密度，對葡萄酒樣進(jìn)行加入回收實(shí)驗(yàn)，以葡萄酒(1#、2#、3#、4#、5#)作為空白基質(zhì)，在0.005 mg·L-1和0.1 mg·L-12個(gè)添加水平下，每個(gè)水平做5組平行，結(jié)果(表3)表明：5種葡萄酒中戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑的添加回收率在87.3%～107.5%之間，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)在2.8 %～7.5% 之間，表明該方法有較高的準(zhǔn)確度和良好的穩(wěn)定性，可用于葡萄酒樣中4種殺菌劑的殘留檢測。添加濃度均為0.2 mg·L-1的葡萄酒樣的SIM色譜圖，如圖1所示。由于苯醚甲環(huán)唑以順反異構(gòu)體的形式存在，故顯示雙峰。

表3 葡萄酒中三唑類殺菌劑的測定(n=5)

圖1 添加濃度為0.2 mg·L-1 的葡萄酒樣的SIM色譜色譜圖Fig.1 The chromatograms SIM of wine spiking sample (spiked with four triazole fungicides at each of 0.2 mg·L-1)1.penconazole;2.flusilazole;3.flusilazole;4.difenoconazole.

2.3 實(shí)際樣品分析

以所建立的超聲輔助-分散液液微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法，對5種葡萄酒(1#、2#、3#、4#、5#)中戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑的含量進(jìn)行測定。結(jié)果在5種葡萄酒中均未檢測出上述農(nóng)藥，說明這5種葡萄酒中上述農(nóng)藥的殘留量低于方法的檢測限。

3 結(jié)論

本研究選用超聲輔助-分散液液微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法分析葡萄酒中痕量戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑。該方法對供試的4種三唑類殺菌劑顯示出良好的萃取效果，添加回收率在87.3%～107.5%之間，該方法準(zhǔn)確度高，精密度較好。此外，該方法操作簡單，成本低，環(huán)境友好，可用于葡萄酒中戊菌唑、氟硅唑、烯唑醇和苯醚甲環(huán)唑殘留的測定。