薛 煥， 金 雁， 于永麗*

(1.東北大學(xué)理學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110819;2.沈陽(yáng)出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧沈陽(yáng) 110016)

隨著人們對(duì)畜禽產(chǎn)品的需求量逐年遞增，畜禽養(yǎng)殖企業(yè)不斷興起和擴(kuò)大。為追求食品動(dòng)物養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)利益，越來(lái)越多的企業(yè)在動(dòng)物飼養(yǎng)及治療過(guò)程中濫用激素類、抗病毒類以及β-受體激動(dòng)劑類獸藥。但人類長(zhǎng)期食用含有這些獸藥的肉制食品，會(huì)導(dǎo)致獸藥在人體累積，擾亂機(jī)體的激素平衡，引起藥物中毒，抑制機(jī)體的免疫作用，對(duì)人體健康極為不利。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于獸藥殘留的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[1]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3 - 4]等?，F(xiàn)有前處理技術(shù)主要有固相萃取[5]、基質(zhì)固相分散[6 - 7]、超聲波輔助提取[8]、QuECHERS技術(shù)[9 - 12]、中空纖維素膜技術(shù)[13 - 14]等。QuEChERS方法的基本原理是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附基質(zhì)中的雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。中空纖維素膜技術(shù)已廣泛用于化工、生物工程和環(huán)保等領(lǐng)域，其原理主要是利用具有特殊選擇透過(guò)性的有機(jī)高分子材料或無(wú)機(jī)材料，形成不同形態(tài)的膜，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離或凈化。目前，尚未見(jiàn)對(duì)畜禽產(chǎn)品中獸藥檢測(cè)采用QuEChERS與中空纖維素膜凈化相結(jié)合進(jìn)行樣品前處理的報(bào)道。

本研究基于畜禽產(chǎn)品中的豬肉樣品基質(zhì)特點(diǎn)，將QuEChERS方法與中空纖維素膜凈化相結(jié)合對(duì)樣品進(jìn)行前處理，與單一使用QuEChERS方法相比，本實(shí)驗(yàn)中樣品的前處理方法能夠更好地降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)，提高獸藥的回收率。將處理后的樣品上機(jī)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜法(UPLC-QTrap MS/MS)對(duì)豬肉中33種獸藥殘留同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀(美國(guó))；AB SciexQtrap 6500串聯(lián)三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó))；Thermo離心機(jī)(美國(guó))；SartoriusCPA 225D分析天平(德國(guó))；EYELAMG-2200氮吹儀(美國(guó))；IKA組織勻漿機(jī)(德國(guó))。

標(biāo)準(zhǔn)品：雄烯二酮、丙酸諾龍、諾龍、達(dá)那唑、表雄酮、睪酮、美睪酮、群勃龍、氟甲睪酮、寶丹酮、丙酸睪酮、甲睪酮、苯甲酸雌二醇、炔諾酮、17α-羥基孕酮、甲基炔酮、甲羥孕酮、甲地孕酮、美侖孕酮、醋酸氯地孕酮、去氧皮質(zhì)酮、醛固酮、氫化可的松、可的松、甲基潑尼松龍、馬賁特羅、馬布特羅、溴布特羅、克侖特羅、特布他林、萊克多巴胺、金剛烷胺、咪喹莫特，均購(gòu)自Alta Sientific公司，純度均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純；十八烷基硅烷(C18)填料、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)填料、中性Al2O3填料、中空纖維素膜，均購(gòu)自天津博納艾杰爾公司。

豬肉樣品購(gòu)于本地市場(chǎng)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：將體積為1 mL的100 μg·mL-1單標(biāo)溶液用乙腈稀釋為10.0 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，置于10 mL棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：根據(jù)需要取相應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容、搖勻，置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理

取2.0 g肉糜樣品，置于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈，經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)。另取5 mL乙腈清洗均質(zhì)機(jī)，將兩次均質(zhì)后的乙腈混合，渦旋混勻1 min后，超聲20 min，9 000 r·min-1離心10 min。取6 mL上清液，置于15 mL凈化管中(300 mg C18+150 mg PSA)，渦混1 min，4 000 r·min-1離心5 min。取5 mL上清液，在45 ℃下，采用氮?dú)獯蹈蓛x濃縮至1 mL，取0.5 mL濃縮液，轉(zhuǎn)移至聚丙烯中空纖維素膜組件中，4 000 r·min-1離心5 min，收集濾液，待測(cè)。

1.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱為AgelaVenusil MP C18柱(50×3.0 mm i.d.，3 μm)，柱溫為25 ℃，樣品室溫度為室溫，進(jìn)樣體積為5 μL，流速為0.4 mL·min-1，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫程序?yàn)椋?%B(0～1.0 min)，15%～75%B(1.1～9.5 min)，95%B(9.6～11.5 min)，3%B(11.6～13.5 min)。

質(zhì)譜條件：離子源采用Turbo VTM離子源，電噴霧正電離源(ESI+)，氣簾氣25 psi，霧化氣50 psi，輔助加熱氣60 psi，霧化電壓5 500 V，離子源溫度550 ℃。33種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 33種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

SerialnumberCompoundRetention time(min)Ion pair(m/z)Declustering potential(V)Collision energy(eV)19Desoxycorticosterone7.63331.2/97.1*331.2/109.190283020Methyl testosterone7.84303.2/109.1*303.2/97.190343021Androstenedione7.94287.2/97*287.2/10910726302217alpha-Hydroxyprogesterone8.01331.3/97.1*331.3/109.197283323Melengestrol8.31355.2/279.2*355.2/221.270265124D-(-)-norgestrel8.4313.3/109.1*313.3/245.2100342325Epiandrosterone8.42291.2/255.1*291.2/273.27017926Megestrol8.43343.2/325.3*343.2/267.260202527Medroxyprogesterone8.71345.3/123.1*345.3/9780313028Mesterolone8.88305.1/269.2*305.1/173.2120223029Danazol9.56338.3/148.1*338.3/120.130313530Chlormadinone9.63405.2/309.2*405.2/345.370221731Nadrolone propionate10.61331.2/109.2*331.2/145.145333032Testosterone propionate10.82345.3/109.1*345.3/97.110032283317beta-Estradiol-benzoate10.91377.2/105.1*377.2/135.2692420

*Quntification ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)條件的選擇

圖1 33種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of mixed standard solution of 33 veterinary drugs20 ng·mL-1,1-33:the names of the substances are shown in Table 1.

本實(shí)驗(yàn)中雄激素類、雌激素類、孕激素類、糖皮質(zhì)激素類藥物均屬于弱極性或中等極性藥物，易溶于乙腈。β-受體激動(dòng)劑類、抗病毒類藥物屬于水溶性藥物，易溶于水。所以本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈和水的混合體系作為流動(dòng)相，并在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸，以提供質(zhì)譜離子化時(shí)所需的H+，保證化合物在質(zhì)譜下的離子化?？紤]到目標(biāo)物的極性差異較大，為了保證分析物能夠很好地分離，采用梯度洗脫程序，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，確定具體洗脫程序見(jiàn)1.4節(jié)。

根據(jù)33種獸藥的化學(xué)性質(zhì)，質(zhì)譜電離條件采用電噴霧正電離源(ESI+)。在正離子模式下，首先進(jìn)行母離子掃描，確定待測(cè)藥物的母離子，然后對(duì)其進(jìn)行子離子掃描，確定其中豐度最強(qiáng)的兩個(gè)子離子作為監(jiān)測(cè)離子，優(yōu)化子離子的去簇電壓及碰撞能量，結(jié)果見(jiàn)表1。采用本實(shí)驗(yàn)所建立的液-質(zhì)檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，33種獸藥的提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

將33種獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(每種獸藥的濃度均為5.0 ng·mL-1)加入到空白的豬肉樣品中，以此作為樣品溶液，對(duì)QuEChERS方法中采用的提取溶劑和凈化填料以及中空纖維素膜進(jìn)行了選擇。

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化針對(duì)所檢測(cè)的33種獸藥的性質(zhì)，考察了乙腈/水(體積比90∶10)、乙腈/水(體積比75∶25)、0.1%甲酸乙腈溶液、乙腈四種提取溶劑對(duì)獸藥回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其中9種獸藥的回收率有較為顯著的差異(圖2)，其余獸藥的回收率在60%～120%之間。結(jié)果表明以乙腈作為提取溶劑，提取效果優(yōu)于其它3種提取溶劑的提取效果。

2.2.2凈化填料的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)先分別考察了PSA、C18、Al2O3單一填料對(duì)目標(biāo)物的吸附情況，發(fā)現(xiàn)PSA對(duì)目標(biāo)物的吸附影響最低，所以選擇PSA作為基本填料，再分別加入一定量的C18和Al2O3吸附劑組成混合填料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用PSA時(shí)獸藥的回收率在62.8%～91.4%之間；使用PSA和C18混合填料時(shí)回收率在72.3%～97.7%之間，使用PSA和Al2O3混合填料時(shí)回收率在49.8%～83.3%之間，所以PSA和C18混合填料的凈化效果最好。然后對(duì)PSA和C18混合填料的比例，分別為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1 時(shí)獸藥的回收率進(jìn)行考察，結(jié)果表明，采用以上混合比例時(shí)，33種獸藥的回收率范圍分別為72.3%～97.7%、77.5%～101.2%、70.8%～108.2%、66.4%～94.7%、61.7%～95.8%。從以上數(shù)據(jù)來(lái)看，當(dāng)PSA與C18混合填料比例為1∶2時(shí)，33種獸藥的回收率最好。

2.2.3中空纖維素膜的選擇實(shí)驗(yàn)考察了樣品溶液在上機(jī)檢測(cè)前分別經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜和中空纖維素膜過(guò)濾凈化后的效果，通過(guò)對(duì)比兩種情況下獸藥的提取離子色譜圖(圖3)，發(fā)現(xiàn)咪喹莫特等大部分獸藥經(jīng)中空纖維素膜過(guò)濾后的響應(yīng)值明顯高于經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后響應(yīng)值，藥物的回收率更高。

本實(shí)驗(yàn)采用的中空纖維素膜是在膜的孔表面接枝上丙烯酸基團(tuán)的聚丙烯中空纖維超濾膜，丙烯酸基團(tuán)的接枝進(jìn)一步縮小膜孔的直徑，可以達(dá)到接近納濾的作用，可以以物理過(guò)濾的方式去除樣品中大分子量雜質(zhì)。因此，在肉類基質(zhì)的獸藥殘留檢驗(yàn)中，它比傳統(tǒng)的濾膜具有更加徹底的凈化效果，降低基質(zhì)效應(yīng)，提高獸藥的回收率。

圖2 9種獸藥經(jīng)四種提取溶劑分別提取后的回收率Fig.2 The recoveries of 9 veterinary drugs extracted by four different extraction solvents

圖3 33種獸藥過(guò)不同膜的提取離子色譜圖(5 ng·mL-1)Fig.3 Extracted ion chromatograms of 33 veterinary drugs by different membrane(5 ng·mL-1)

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

配制濃度為0.5～80.0 ng·mL-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以獸藥標(biāo)準(zhǔn)色譜峰峰面積(y)對(duì)其相應(yīng)濃度(x)進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和線性范圍。其中，金剛烷胺、甲基潑尼松龍、醛固酮3種獸藥為2.0～80.0 ng·mL-1，其余30種獸藥為0.5～80.0 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)r為0.9901～0.9995。

在豬肉的空白樣品中添加33種獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成0.5、2.0和10 μg·kg-1的3個(gè)添加水平的加標(biāo)樣品(其中金剛烷胺、甲基潑尼松龍和醛固酮為2.0和10 μg·kg-1的2個(gè)添加水平)，按建立的分析方法進(jìn)行測(cè)定。除去馬布特羅在添加水平為0.5 μg·kg-1時(shí)回收率為57.1%，其余獸藥在不同添加水平時(shí)的回收率為60.9%～102.3%，RSD為1.7%～22.8%。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T27404-2008)[15]中對(duì)被測(cè)組分含量<0.1 mg·kg-1時(shí)回收率需達(dá)到60%～120%的要求，除馬布特羅在加標(biāo)為0.5 μg·kg-1時(shí)回收率偏低，其余獸藥的回收率滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。以每種獸藥能夠被定量測(cè)定的最低限作為定量限，金剛烷胺、甲基潑尼松龍和醛固酮的定量限為2.0 μg·kg-1，其余為0.5 μg·kg-1，以3倍信噪比作為儀器檢出限，檢出限范圍為0.03～0.57 μg·kg-1。能夠滿足中國(guó)、日本、歐盟的食品安全標(biāo)準(zhǔn)要求。33種獸藥的線性回歸方程、定量限和回收率見(jiàn)表2。

表2 33種獸藥的線性回歸方程、定量限和回收率(n=6)

(續(xù)表2)

CompoundLinear equationLOD(μg·kg-1)LOQ(μg·kg-1)0.5 μg·kg-12.0 μg·kg-110.0 μg·kg-1Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Bromobuteroly=1.62×106x+2.30×1050.030.585.911.778.53.082.010.9Lmiquimody=9.42×106x-6.97×1050.040.587.18.685.42.589.54.6Mabuteroly=2.88×106x-4790.050.557.110.765.74.479.013.2Mapenteroly=3.95×106x-2.65×1050.100.572.212.680.12.587.216.3Methylprednisoloney=3.75×104x-5.80×1030.572.0//82.411.089.913.7Aldosteroney=1.65×104x-4.92×1030.252.0//86.26.984.17.8Hydrocortisoney=1.99×105x-1.22×1040.070.562.46.979.510.591.83.4Cortisoney=3.04×105x+1.05×1040.040.569.72.285.315.989.66.8Fluoxymesteroney=1.75×105x+4.70×1030.080.582.47.192.42.890.82.9Trenboloney=5.99×105x-1.25×1040.090.574.05.089.22.991.65.2Boldenoney=5.99×105x+5.97×1030.030.584.85.890.82.592.54.4Nortestosteroney=3.99×105x+5.22×1030.090.586.37.689.32.490.13.0Testosteroney=7.89×105x-7.04×1030.040.581.23.778.812.987.64.3Norethindroney=2.63×105x+1.05×1040.060.584.95.690.52.087.33.7Desoxycorticosteroney=8.09×105x+2.91×1030.030.565.24.770.23.789.42.8Methyl testosteroney=4.98×105x+2.33×1040.030.583.75.5102.37.790.03.1Androstenedioney=1.35×106x+6.01×1030.050.589.23.986.16.192.73.017alpha-Hydroxyprogesteroney=5.14×105x-4.42×1040.050.587.84.396.53.892.82.7Melengestroly=7.80×105x-4.00×1030.030.571.311.587.72.789.22.2D-(-)-norgestrely=2.88×105x+9.95×1030.090.588.15.392.67.490.66.1Epiandrosteroney=2.16×105x-4.47×1030.150.561.619.071.42.885.97.2Megestroly=5.02×105x-8.51×1040.120.585.712.090.39.786.73.6Medroxyprogesteroney=1.10×106x-2.41×1040.060.584.23.192.51.790.24.9Mesteroloney=2.83×105x-1.17×1040.090.582.74.285.53.385.66.9Danazoly=1.49×105x-4.66×1030.060.581.45.588.52.086.012.5Chlormadinoney=2.88×105x+5420.030.567.15.880.32.687.113.9Nadrolone propionatey=2.45×105x+1.85×1050.080.574.54.977.76.086.41.7Testosterone propionatey=6.31×105x+1.28×1050.040.575.72.688.15.485.49.517beta-Estradiol-benzoatey=1.51×105x+1.31×1050.140.576.85.082.96.394.56.5

圖4 克倫特羅的提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of Clenbuterol

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本研究建立的分析方法對(duì)市售豬肉樣品進(jìn)行了33種獸藥的篩查檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為(μg·kg-1)：特布他林0.9，克倫特羅1.6，丙酸睪酮2.5，其它30種獸藥未檢出，圖4為克倫特羅檢測(cè)圖。由檢測(cè)結(jié)果可知，部分獸藥殘留在豬肉產(chǎn)品中，對(duì)人們的身體健康具有潛在的危害。

3 結(jié)論

本研究將QuEChERS方法與中空纖維素膜凈化相結(jié)合，建立了一種新型的樣品前處理技術(shù)，在對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀，建立了可同時(shí)檢測(cè)33種獸藥的分析方法。該方法的靈敏度高、分析速度快，節(jié)約成本，可滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)豬肉樣品日常檢驗(yàn)分析的要求。