周煥芹

[摘要] 目的 研究周期蛋白激酶（CDKs）抑制劑夫拉平度（Flavopiridol， FP）對人宮頸癌CasKi細胞裸鼠皮下移植瘤生長和轉移的影響。方法 2017年7—8月在聊城市人民醫(yī)院中心實驗室建立CasKi細胞裸鼠模型，隨機分為對照組、順鉑組、FP組及FP和順鉑聯(lián)合用藥組，每組8只裸鼠，4組均于腫瘤抑制成功后瘤體直徑平均為0.8 cm開始給藥，給藥3周，2次/周。最后一次給藥5 d后處死全部裸鼠，測量移植瘤的體積和重量，采用免疫印跡法檢測對各組中腫瘤組織凋亡蛋白Caspase 3表達的影響，并采用分光光度法測定裸鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平。結果 與對照組相比[（567.02±89.38）V/mm3；（0.63±0.07）m/g]，順鉑組[（114.50±18.07）V/mm3，（0.12±0.04）m/g]、FP組[（106.74±21.39）V/mm3；（0.10±0.02）m/g]及FP和順鉑聯(lián)合用藥組[（88.59±19.84）V/mm3，（0.07±0.02）m/g]荷瘤體積和重量明顯減?。≒<0.05）；順鉑組、FP組及FP和順鉑聯(lián)合用藥組Caspase 3表達均顯著增加（P<0.05）；與對照組相比[（134.68±45.63）U/mL，（3.45±1.47）mmol/L]，順鉑組[（143.72±44.45）U/mL，（2.76±2.83）mmol/L]、FP組[（156.51±32.53）U/mL，（2.64±0.66）mmol/L]及FP和順鉑聯(lián)合用藥組[（208.37±63.35）U/mL，（2.38±1.13）mmol/L]血清SOD的活性顯著升高（P< 0.05），MDA的含量顯著降低（P< 0.05）。結論 夫拉平度對人宮頸癌CasKi細胞皮下種植瘤生長具有抑制作用，且與促進癌細胞的凋亡，抑制機體氧化應激反應有關。

[關鍵詞] 夫拉平度；順鉑；宮頸癌；生長抑制；凋亡； 氧化應激

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）04（c）-0018-04

Research on Inhibition Effect of Flavopiridol on the Growth of in Human Cervical Carcinoma CasKi Subcutaneous Implanted in Nude Mice

ZHOU Huan-qin

Department of Pharmacy， Liaocheng Peoples Hospital， Liaocheng， Shandong Province， 252000 China

[Abstract] Objective To study the effect of flavopiridol （FP） on human cervical carcinoma subcutaneous implanted tumor growth inhibition in mice bearing CasKi cell. Methods The nude rat model of cervical cancer cell was established from July to August 2017 in Central laboratory of Liaocheng Peoples Hospital. The nude rat were randomly divided into four groups （control group， cisplatin group， FP group and combined treatment group， 8 rats in each group）， and the four groups were administered when the average tumor diameter was 0.8 cm， 3 w， and 2 times/w， and all the mice were sacrificed in 5 days after the adminitration， and the volume and weight of tumors were tested. And the expression of caspase3 was determined by immunoblotting. And the SOD and MDA levels were measured by the spectrophotometry. Results The tumor volume and weight obviously decreased in the cisplatin group[（114.50±18.07）V/mm3；（0.12±0.04）m/g]， FP group[（106.74±21.39）V/mm3； （0.10±0.02）m/g] and combined treatment group[（88.59±19.84）V/mm3；（0.07±0.02）m/g]（P<0.05） compared with that in the control group[（567.02±89.38）V/mm3；（0.63±0.07）m/g）]， and the expression of caspase 3 in the cisplatin group， FP group and combined treatment group obviously increased compared with that in the control group [（134.68±45.63）U/mL，（3.45±1.47）mmol/L]. The activition of serum SOD in the cisplatin group[（143.72±44.45）U/mL，（2.76 ±2.83）mmol/L]， FP group[（156.51±32.53）U/mL，（2.64±0.66）mmol/L] and combined treatment group[（208.37±63.35）U/mL，（2.38±1.13）mmol/L] obviously increased （P<0.05）， the contents of MDA obviously decreased （P<0.05）. Conclusion FP has an inhibition effect on the growth of in human cervical carcinoma CasKi subcutaneous implanted in nude mice， which is related to promoting the apoptosis of cancer cells and inhibiting the oxidative stress reaction of the body.

[Key words] Flavopiridol； Cisplatin； Cervical carcinoma； Growth inhibition； Apoptosis； Oxidative stress

宮頸癌是危害女性健康常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率較高，在發(fā)展中國家婦女中其發(fā)病率居第一位，且近年來宮頸癌發(fā)病率上升趨勢明顯[1-2]。因此，尋找治療宮頸癌的有效方法是目前的研究熱點之一。早期宮頸癌治療后患者5年生存率較高，然而對于中晚期宮頸癌患者，易出現(xiàn)周圍組織腫瘤轉移，手術和放療均難取得滿意的治療效果。因此，化療在宮頸癌治療中日益受到重視，然而目前化療藥物均存在不良反應大、久用易產(chǎn)生耐藥性等缺點，因此尋找選擇性高、不良反應小而有效的宮頸癌治療藥物尤為重要。夫拉平度（Flavopiridol， FP）為周期蛋白激酶（CDKs）抑制劑，通過降低腫瘤細胞內(nèi)紊亂的CDK激酶活性，可以抑制人白血病細胞、食道和胃癌及乳腺癌細胞的增殖[3-4]。另有研究[5-6]報道宮頸癌細胞內(nèi)CDKs表達較正常組織增加，然而夫拉平度對宮頸癌的治療作用機制尚未明確。因此，該研究在2017年7—8月間采用人宮頸癌CasKi細胞裸鼠皮下種植瘤模型，隨機分為對照組、順鉑組、FP組及FP和順鉑聯(lián)合用藥組，每組8只裸鼠，通過給予FP觀察FP及FP和順鉑聯(lián)合用藥對宮頸癌裸鼠皮下種植瘤生長不同程度的抑制作用及對血清SOD的影響并探討其可能機制，以期為宮頸癌新的臨床治療途徑提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

Balb/c雌性裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF級飼養(yǎng)，4～6周齡，體重18～22 g， 該研究嚴格遵守聊城市人民醫(yī)院動物實驗管理相關規(guī)定，并通過了倫理委員會審批；人宮頸癌CaSki細胞株購自北京腫瘤研究所；順鉑（6 mL∶30 mg，批號：170603）；兔抗人Caspase-3多克隆抗體購自Cell Signaling；FP購自sigma（批號：S159342）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、蛋白質分子量標準、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均來自碧云天生物技術研究所；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞于含RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液pH 7.2～7.4，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液1次/2～3 d。

1.2.2 宮頸癌裸鼠荷瘤模型的建立 取指數(shù)生長期得腫瘤細胞，胰酶消化后，以10%磷酸鹽緩沖溶液（PBS）制成濃度為1×107個/mL細胞的細胞懸液中，然后碘伏及75%酒精常規(guī)消毒裸鼠左腋下皮膚后，取0.2 mL的CaSki細胞懸液分別注射于裸鼠的左前肢腋下，注射結束后用鑷子夾緊針孔，防止細胞懸液滲漏。

1.2.3 分組及治療 接種結束后將32只棵鼠隨機分為對照組、順鉑組、FP組及聯(lián)用組。自接種后28 d，待裸鼠荷瘤瘤體直徑均值（mean tumor diameter， MTD）達8 mm大小時開始給藥治療，對照組以0.2 mL生理鹽水腹腔內(nèi)注射；順鉑組腹腔內(nèi)注射0.2 mL順鉑（批號：170603），劑量為2 mg/（kg·d）；FP組腹腔內(nèi)注射0.2 mL FP（批號：S159342），劑量為10 mg/kg；聯(lián)用組順鉑與FP聯(lián)合給藥[順鉑2 mg/（kg·d），F(xiàn)P 10 mg/kg]。4組均給藥3周，給藥2次/周。

1.2.4 腹水及盆腔內(nèi)轉移情況 最后一次給藥5 d后，脫臼處死全部裸鼠并打開腹腔，仔細檢查有無腹水，依次探查腹腔和盆腔內(nèi)臟器，觀察腫瘤轉移灶情況。

1.2.5 各組裸鼠皮下移植瘤重量及體積的測量 完整剝離各組腫瘤組織并準確測量腫瘤重量；用游標卡尺測量腫瘤的最長徑和最短徑，計算腫瘤體積。體積按照公式V=1/πab2計算（a為瘤塊最大徑，b為最小徑）。

1.2.6 免疫印跡法檢測腫瘤組織Caspase-3表達水平 提取腫瘤組織總蛋白，以BCA法進行蛋白定量，加入上樣緩沖液。以100 μg上樣后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，后100 V恒壓轉膜。取轉移后的硝酸纖維素濾膜，封閉后加入兔抗人激活型Caspase-3（1∶1 000）抗體。膜置于一抗中，4℃ 冰箱過夜孵育。洗膜后以二抗孵育2 h。然后TBS洗膜5 min×3次，置BCIP/NBT顯色液顯色。掃描蛋白印跡顯影圖，利用凝膠自動分析成像軟件Image J 軟件計算目的蛋白表達的灰度值。

1.2.7 活性測定 裸鼠處死取血，用于測定MDA 含量和SOD 的活性，按照試劑盒規(guī)定的方法比色測定吸光度，按公式換算成SOD 的活性以及MDA的濃度的活性。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用one-way ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組裸鼠致瘤率

各組裸鼠均于接種7 d后明顯成瘤，移植瘤模型成功建立，接種成功率為100%。

2.2 各組腹水及盆腔轉移情況

裸鼠最后一次給藥5 d后脫臼處死并解剖，各組裸鼠腹腔內(nèi)未見腹水，經(jīng)過腹腔和盆腔各臟器探查，均未見明顯轉移灶。

2.3 各組裸鼠皮下種植瘤重量及體積差異

與對照組相比，順鉑組、FP組和聯(lián)合用藥組荷瘤體積和重量均顯著降低（P<0.05）；此外，與順鉑組相比，聯(lián)合用藥組荷瘤體積及重量均較低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.4 各組裸鼠血清SOD活性和MDA的含量差異

與對照組相比，順鉑組、FP組和聯(lián)合用藥組血清SOD活性均顯著提高（P<0.05），MDA的含量顯著降低（P<0.05）；與順鉑組相比，聯(lián)合用藥組血清SOD活性均顯著提高（P<0.05），MDA的含量顯著降低（P<0.05），見表2。

2.5 各組腫瘤組織中Caspase 3蛋白的表達差異

免疫印跡結果顯示，順鉑組、FP組和聯(lián)合用藥組腫瘤組織Caspase 3蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與順鉑組相比，聯(lián)合用藥組腫瘤組織Caspase 3蛋白表達較高。見圖1。

3 討論

細胞周期的正常運行依賴于精細的調(diào)控機制，CDK為細胞周期調(diào)控網(wǎng)絡的核心，具有促進細胞周期時相轉變、啟動DNA合成、調(diào)控細胞轉錄等重要功能[7-8]。當CDK失調(diào)控時，可導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)約90%的腫瘤存在CDK的活性增強[9-12]，因此，近幾年CDKs已成為腫瘤治療的重要研究靶點。同時研究顯示[4，9，12]，宮頸癌組織和癌旁組織內(nèi)CDKs過表達，且CDKs的表達與宮頸癌惡性程度、分化等密切相關。

FP為最初來源于一種印度植物的黃酮物質，因具有CDKs抑制活性，其抗腫瘤活性近年逐漸受到關注。近年研究[13]發(fā)現(xiàn)FP對白血病細胞、食道和胃癌細胞的增殖具有較好的抑制作用，其中胃癌的腫瘤細胞抑制率可達85%，其抗腫瘤活性與阻斷細胞周期、誘導凋亡、抑制血管生長等機制有關。該文研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)P對人宮頸癌CasKi細胞裸鼠皮下移植瘤的體積和重量的增加具有顯著抑制作用；另外，該研究采用FP聯(lián)合一線化療藥物順鉑聯(lián)合用藥，發(fā)現(xiàn)二者具有協(xié)同抗腫瘤作用，其對腫瘤的體積和重量增高的抑制效應顯著增強，腫瘤的體積的重量都顯著低于對照組。同時發(fā)現(xiàn)較對照組，F(xiàn)P和FP順鉑聯(lián)合用藥可顯著降低裸鼠血清MDA的含量，提高SOD的活性。這說明FP對宮頸癌移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，同時可顯著降低機體氧化應激水平，且與順鉑聯(lián)用大大增強順鉑對宮頸癌的治療效果。

另外，抑制CDKs可限制腫瘤細胞的過度生長及加速細胞凋亡，已有研究[14]發(fā)現(xiàn)FP可使乳腺癌細胞阻滯在G1和G2期，并引起細胞的凋亡，凋亡率可達90%，其機制可能與FP直接抑制CDK2和CDK3的活性有關。該研究發(fā)現(xiàn)FP可上調(diào)裸鼠腫瘤組織凋亡相關蛋白Caspase 3蛋白的表達，這一結果與前期報道相一致[15]；此外，聯(lián)合用藥組腫瘤組織內(nèi)Caspase 3蛋白表達較順鉑單獨用藥組高，這提示，F(xiàn)P對人宮頸癌CasKi細胞裸鼠皮下種植瘤生長的抑制作用可能與其誘導腫瘤細胞程序化凋亡有關。

綜上所述，F(xiàn)P對人宮頸癌CasKi細胞裸鼠皮下種植瘤生長抑制作用，其保護作用與促進腫瘤組織細胞的凋亡及降低機體的氧化應激水平有關；此外，F(xiàn)P與順鉑聯(lián)合用藥可以增強順鉑對宮頸癌生長的抑制效果，該研究將為宮頸癌新化療藥物的研究提供實驗依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Rawlance Ndejjo， Trasias Mukama， Angele Musabyimana， et al. Uptake of Cervical Cancer Screening and Associated Factors among Women in Rural Uganda： A Cross Sectional Study[J]. PLoS One， 2016， 11（2）： e0149696.

[2] 王立維， 高樹強， 李平， 等. 七氟烷聯(lián)合丙泊酚對老年腹腔鏡宮頸癌切除術患者術后認知功能及血清SOD水平影響研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志， 2017， 27（19）： 87-90.

[3] Calvin R， Justus， Edward J， et al. Molecular Connections between Cancer Cell Metabolism and the Tumor Microenvir onment[J].Int J Mol Sci， 2015，16（5）：11055-11086.

[4] 梅興明， 梁智敏，張嬿，等.宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織CDK8表達臨床意義[J].中華腫瘤防治雜志，2016，23（S2）：48-49.

[5] Gabriel De Leon， Margaret Cavino， Mikilyn DAngelo， et al. PNUTS knockdown potentiates the apoptotic effect of Roscovitine in breast and colon cancer cells[J]. Int J Oncol， 2010， 36（5）： 1269–1275.

[6] 王維莉， 王萍， 王峰， 等. RhoA/ROCKI 信號通路在紫杉醇誘導宮頸癌細胞周期阻滯中的作用[J].解剖學報，2013， 44（4）： 485-491.

[7] Keith I. Block， Charlotte Gyllenhaal， Leroy Lowe，et al.A Broad-Spectrum Integrative Design for Cancer Prevention and Therapy[J]. Semin Cancer Biol， 2015， 35（Suppl）： S276-S304.

[8] 薛宏，汪光慧，李勇，等.宮頸癌組織中CDK8、p53、VEGF表達水平與腫瘤血管生成的關系研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志， 2017， 27（29）： 39-44.

[9] Shireen Chikara， Kaitlin Lindsey， Harsharan Dhillon， et al. Enterolactone induces G1-phase cell cycle arrest in non-small cell lung cancer cells by down-regulating cyclins and cyclin-dependent kinases[J]. Nutr Cancer， 2017，69（4）： 652-662.

[10] Matthew P. Swaffer， Andrew W. Jones， Helen R. Flynn， et al. I CDK Substrate Phosphorylation and Ordering the Cell Cycle [J]. Cell. 2016， 167（7）： 1750-1761.

[11] CROWN J.CDK8： a new breast cancer target[J]. Oncotar get， 2017， 8 （9） ：14269-14270.

[12] JABBOUR-LEUNG NA， CHEN X， BUI T， et al. Sequential combination therapy of CDK inhibition and doxorubicin is synthetically lethal in p53-mutant triple-negative breast cancer[J]. Mol Cancer Ther， 2016， 15（4）：593-607.

[13] Nicole M. Davis， Melissa Sokolosky， Kristin Stadelman， et al. Deregulation of the EGFR/PI3K/PTEN/Akt/mTORC1 pathway in breast cancer： possibilities for therapeutic intervention[J]. Oncotarget， 2014， 5（13）： 4603–4650.

[14] Xavier Bisteau， Sabine Paternot， Bianca Colleoni，et al. CDK4 T172 Phosphorylation Is Central in a CDK7-Dependent Bidirectional CDK4/CDK2 Interplay Mediated by p21 Phosphorylation at the Restriction Point[J].PLoS Genet， 2013，9（5）： e1003546.

[15] C Norez， C Vandebrouck， J Bertrand， et al. Roscovitine is a proteostasis regulator that corrects the trafficking defect of F508del-CFTR by a CDK-independent mechanism[J].Br J Pharmacol， 2014， 171（21）： 4831-4849.

（收稿日期：2018-01-22）