單煒　趙麗娟

[摘要] 目的 研究高遷移率族蛋白B1（HMGB1）在2型糖尿病伴牙周病牙齦組織中表達。方法 研究對象30例均方便選取于2014年3月—2015年1月間大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院口腔科，分為實驗組：2型糖尿病伴牙周病A組10例、慢性牙周炎B組10例及對照組：健康C組10名。收集牙齦組織，分別通過免疫組織化學(xué)染色檢測牙齦組織中HMGB1的表達并運用Image-Pro Plus （6.0）圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。結(jié)果 糖尿病伴牙周病組牙齦組織中HMGB1的平均光密度表達量（0.031 2±0.009 9）高于單純牙周病組（0.022 6±0.009 4）和正常對照組（0.014 5±0.006 6）（P<0.05）。 結(jié)論 HMGB1可能與糖尿病伴牙周病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 高遷移率族蛋白B1； 糖尿病伴牙周??；牙周??； IPP

[中圖分類號] R587 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）04（c）-0037-03

Expression of High Mobility Group Protein B1 in Type 2 Diabetes with Periodontitis Gingival Tissue

SHAN Wei1， ZHAO Li-juan2

1.Department of Stomatology， Children's Hospital Affiliated to the Medical School of Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang Province， 310051 China；2.Department of Stomatolog， Medical School of Dalian University， Dalian， Liaoning Province， 116622 China

[Abstract] Objective To research the expression of high mobility group protein B1 in type II diabetes with periodontitis gingival tissue. Methods 30 cases of patients from March 2014 to January 2015 were conveniently selected as the research objects and divided into three groups with 10 cases in each， the group A were the patients with diabetes combined with periodontal disease， the group B were the patients with chronic periodontitis， and the group C were the healthy people， and the expression of HMGB1 in the gingival tissues was tested by the immunohistochemistry staining， and the Image-Pro Plus （6.0） imaging analysis system was for quantitative analysis. Results The average optical density expression of HMGB1 of patients with diabetes with periodontitis gingival tissue was higher than that of simple periodontitis gingival tissue and normal control group[（0.031 2 ± 0.009 9） vs （0.022 6±0.009 4），（0.014 5±0.006 6）]（P<0.05）. Conclusion The HMGB1 may be related to the occurrence and development of diabetes with periodontitis gingival tissue.

[Key words] High mobility group protein B1； Diabetes with periodontitis gingival tissue； Periodontitis； IPP

牙周病與糖尿病作為威脅人類健康的慢性感染性口腔疾病和內(nèi)分泌代謝性疾病，兩者之間的關(guān)聯(lián)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，兩者之間相互影響、互為因果[1]。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）是一種參與多種細胞核生命活動的重要核內(nèi)蛋白，但在胞外環(huán)境中可發(fā)揮炎性細胞因子的作用，激活涉及免疫或炎癥反應(yīng)的各類細胞[2]。因其獨特的生物學(xué)活性和致炎機制，HMGB1受到各個領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。隨著研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HMGB1在嚴重牙周病患者牙周組織中的表達水平顯著升高；HMGB1受體糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of advance glycation end products，RAGE）在2型糖尿病伴牙周病患者牙齦組織中的表達顯著高于單純牙周病患者 [3]，認為HMGB1在糖尿病合并牙周病的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了重要的作用，但相關(guān)領(lǐng)域的報道相對較少。該實驗于2014年3月—2015年1月間收集30例人牙齦組織，通過免疫組織化學(xué)染色和圖像定量分析研究HMGB1在糖尿病伴牙周病牙齦組織中的表達情況，探討HMGB1在糖尿病伴牙周病的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HMGB1多克隆抗體（兔來源）和兩步法免疫組化檢測試劑盒，BX51型生物顯微鏡及IX41型熒光倒置顯微鏡（含攝像系統(tǒng)），圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0。

1.2 樣本收集

30例樣本均方便選取于大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院就診的患者。該研究對2型糖尿病的診斷符合WHO糖尿病專家委員會提出的診斷標準[4] ；牙周病的診斷符合第二版《臨床牙周病學(xué)》中對慢性牙周炎的診斷標準[5]。所有參與者均無身體其他部位的炎癥及系統(tǒng)性疾病且至少半年內(nèi)未接受任何牙周治療，1個月內(nèi)未服用任何的抗生素、非甾體抗炎藥。糖尿病伴牙周?。ˋ）組（男、女各5例，47～65歲）及單純牙周?。˙）組（男、女各5例；年齡46～64歲），樣本取自牙齦翻瓣手術(shù)過程中切取的病變牙齦組織；正常對照（C）組（男、女各5名；年齡17～35歲）為健康人群，樣本取自阻生齒拔除術(shù)過程中切取的正常牙齦組織。所有參與者都被告知研究目的及手術(shù)取樣情況并同意，且經(jīng)該院倫理委員會批準。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

切取的30例牙齦組織常規(guī)固定石蠟包埋，沿牙齦頰舌向縱行切連續(xù)片3 μm，攤片。組織切片經(jīng)脫蠟和水化后，分別進行高壓抗原修復(fù)、非特異性封閉、非特異性蛋白封閉。后加入抗HMGB1抗體（1/100）室溫（27℃）下孵育1 h，滴加聚合HRP標記抗兔IgG，室溫（27℃）下孵育30 min，反復(fù)沖洗后經(jīng)顯色、復(fù)染分化反藍、脫水透明后封片，鏡下觀察。

1.4 圖像采集及分析

在相同實驗條件下，將30例免疫組化染色的切片，置于100倍光鏡下觀察。對每張切片隨機選取3個視野進行圖像采集（共90張）。為減少主觀性所帶來的誤差，將3組圖片順序打亂，用Image-Pro Plus（6.0）圖像分析系統(tǒng)，雙盲分析測量圖像中陽性細胞染色的積分光密度（IOD）及所測量區(qū)域的面積（Area），并計算HMGB1表達的平均光密度（Density Mean，平均光密度=積分光密度/所測區(qū)域面積）。

1.5 統(tǒng)計方法

通過SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對3組計算所得HMGB1的平均光密度進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）及多重比較，以α=0.05為檢驗基準。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

糖尿病伴牙周病組、單純牙周病組和健康對照組牙齦組織中HMGB1的平均光密度分別為（0.031 2±0.009 9）、（0.022 6±0.009 4）和（0.014 5±0.006 6）。3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），糖尿病伴牙周病組明顯高于單純牙周病組和健康對照組。

3 討論

HMGB1作為一種晚期炎癥調(diào)節(jié)因子，可在巨噬細胞/單核細胞、中性粒細胞、樹突細胞受到如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等外源性細菌內(nèi)毒素或腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha ，TNF-α）等內(nèi)源性促炎細胞因子的刺激后以主動分泌或被動釋放的方式分布到胞外環(huán)境中 [6]。釋放到胞外的HMGB1與存在于多種細胞表面的RAGE、TLR2、TLR4等受體結(jié)合從而激活固有免疫細胞，與RAGE結(jié)合激活ERK-1/2和NF-κB信號傳導(dǎo)通路，與TLR2、 TLR4結(jié)合激活NF-κB通路。炎癥信號通路的激活可進一步的釋放TNF-α、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（IL-6）等促炎細胞因子，從而導(dǎo)致局部的炎癥反應(yīng)進一步加重[7]。正是由于HMGB1與促炎細胞因子之間的這種相互作用機制，形成了一條炎性細胞因子的正反饋調(diào)節(jié)通路，從而使得HMGB1在炎癥反應(yīng)的發(fā)生進展中起到了維持、延長甚至縱向惡化的作用，也解釋了該實驗中慢性牙周病患者牙齦組織中HMGB1表達的量（0.022 6 ±0.009 4）明顯高于正常對照組（0.014 5±0.006 6）的結(jié)果。同時，該實驗結(jié)果也與ZHaoH等[8]發(fā)現(xiàn)牙周炎組齦溝液中HMGB1的表達量（39.8±1.1）ng明顯高于健康對照組（32.1±3.5）ng相對應(yīng)。

隨著牙周病與糖尿病關(guān)系研究的深入，如TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子在兩者關(guān)系中起到了重要作用。同時，由于HMGB1與炎性細胞因子形成的正反饋調(diào)節(jié)通路，HMGB1在牙周病、糖尿病伴牙周病的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮了作用[7，9]。Luo L等[10]通過實時定量PCR檢測到牙周病患者牙齦組織中HMGB1的基因表達水平升高；通過Western blotting、ELISA檢測到牙周病患者齦溝液中HMGB1的蛋白水平升高并伴隨IL-1β、IL-6等促炎細胞因子濃度的相應(yīng)增加。此外，Katz J等[11]通過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)2型糖尿病伴牙周病患者牙齦組織中RAGE的基因水平明顯升高，認為該受體參與糖尿病患者的牙周破壞。研究表明[3]，在高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的牙齦上皮細胞可以釋放更多的HMGB1。這些與該實驗通過免疫組織化學(xué)染色和IPP圖像分析發(fā)現(xiàn)糖尿病伴牙周病患者牙齦組織中HMGB1表達的量升高相對應(yīng)，該結(jié)果可能是由于糖尿病伴牙周病患者牙齦組織中高表達的HMGB1和RAGE相互結(jié)合產(chǎn)生強烈的炎癥信號，進一步產(chǎn)生更多的炎癥細胞因子，從而進一步促進了HMGB1的表達。

綜上所述，與單純牙周病患者和健康者相比，糖尿病伴牙周病患者牙齦組織中HMGB1表達的量明顯升高。高表達的HMGB1可能與糖尿病伴牙周病的發(fā)生和進展有關(guān)，從而為探尋糖尿病伴牙周病的病因和治療提供新的思路。

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（收稿日期：2018-01-28）