尼莫地平對慢性高眼壓兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元損傷的影響

張新躍，黃 帥，王林洪

(華北理工大學附屬醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000)

青光眼是繼白內(nèi)障之后的第2大致盲性疾病，研究顯示，全球青光眼患者在2040年將達到11 180萬，其特征為進行性視神經(jīng)損傷和視野缺損[1-2]。視功能的正常維持依賴于視路中各級神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能上的完整性及協(xié)調(diào)性[3-4]。KITSOS等[5]研究發(fā)現(xiàn)，青光眼是從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGC)、視神經(jīng)、視交叉、視束、外側(cè)膝狀體、視放射到視皮質(zhì)整個視覺通路的廣泛性損傷。本研究通過前房注射復方卡波姆溶液的方法建立兔慢性高眼壓模型，選取尼莫地平作為治療藥物，通過免疫組織化學法檢測凋亡因子Bcl-2及Bax的表達，探究鈣離子通道阻滯劑尼莫地平對慢性高眼壓所致外側(cè)膝狀體損傷的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物隨機選取3月齡健康雄性新西蘭白兔18只(華北理工大學動物實驗中心提供)，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，眼前節(jié)及眼底無異常。相同環(huán)境及飼養(yǎng)方法適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為正常組、損傷組和治療組，每組6只。

1.2主要試劑及儀器左氧氟沙星滴眼液(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，國藥準字H20020327)，尼莫地平片(天津市中央藥業(yè)有限公司，國藥準字H20043915)，5 g·L-1地塞米松注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H37021969)，無菌注射用水(中國大冢制藥有限公司，國藥準字H20044102)，生理鹽水(石家莊四藥股份有限公司，國藥準字H13023200)，甲苯胺藍(上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)，40 g·L-1多聚甲醛(江蘇世泰實驗器材有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(diamino benzidine，DAB)、Bcl-2/Bax兔單克隆抗體/免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Tono-pen AVIA眼壓計(美國強生Mentor公司)；卡波姆940(美國諾譽化工有限公司)。

1.3慢性青光眼模型制備各組兔均以右眼為實驗眼，實驗前3 d開始點左氧氟沙星滴眼液，每次0.2 mL，每日3次。將0.3 g卡波姆940及5 g·L-1的地塞米松注射液5 mL溶入無菌注射用水95 mL中，配置成3 g·L-1的復方卡波姆溶液(含地塞米松0.25 g·L-1)，正常組不予處理，損傷組、治療組兔用注射器針頭經(jīng)角膜緣穿刺進入前房抽取 0.2 mL 房水，推入等量的復方卡波姆溶液建立慢性高眼壓模型，注入后逐漸出現(xiàn)球結(jié)膜充血，角膜霧狀混濁，術(shù)后3 h測量眼壓，均超過2.93 kPa，可見前房輕度加深，瞳孔豎橢圓形，即為造模成功。模型建立后次日開始，治療組兔每日給予尼莫地平13.2 mg·kg-1(溶于無菌注射用水中)灌胃1次，正常組、損傷組兔每日給予等量生理鹽水灌胃1次，連續(xù)灌胃4周，每周稱1次體質(zhì)量，調(diào)整給藥劑量。模型建立后的第1周每日測量眼壓，以后每 3～4 d測量眼壓1次，對于眼壓低于2.93 kPa者給予補充復方卡波姆溶液0.1 mL，剔除眼壓高于 6.67 kPa 者及并發(fā)癥嚴重者，使高眼壓維持至4周。

1.4兔腦外側(cè)膝狀體標本制備模型建立4周后各組兔均采用250 g·L-1烏拉坦耳緣靜脈全身麻醉，固定四肢，沿頸部前方切開皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露兩側(cè)胸鎖乳突肌，自胸骨體切開，頓性分離兩側(cè)肌肉組織，沿氣管兩側(cè)尋找頸總動脈并游離約2 cm，4-0縫線圈套結(jié)扎一側(cè)頸總動脈近心端，遠心端作“T”形切開，插入灌有生理鹽水的留置針并固定，止血鉗夾閉另一側(cè)頸總動脈，剪開兩側(cè)頸總靜脈，灌注生理鹽水約500 mL，至兩側(cè)頸總靜脈流出澄清液體，檢查可見舌頭、結(jié)膜失去血色，改用 40 g·L-1多聚甲醛(500 mL)經(jīng)輸液加壓袋加壓至300 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)快速灌注15 min(約 20 mL·min-1)，控制流速至10 mL·min-1再緩慢灌注 30 min，完成固定后，用咬骨鉗自兩側(cè)眶上壁咬開顱骨，小心去除顱骨，取出完整腦組織，立即用40 g·L-1多聚甲醛固定48 h以上。去除大腦半球，選取包含外側(cè)膝狀體的中腦組織，經(jīng)脫水、透明后進行石蠟包埋，切片，貼片。

1.5Nissl染色觀察兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元形態(tài)切片置于60 ℃烤箱60 min后放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中完成脫蠟，浸入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、體積分數(shù)95%、80%乙醇中，自來水洗滌后將玻片放入濕盒內(nèi)，滴加預熱至50 ℃的甲苯胺藍染液，在60 ℃溫箱中染色20 min，蒸餾水洗去浮色；體積分數(shù)95%乙醇分色，顯微鏡下觀察。將切片浸入盛有自來水的容器中藍化20 min，以尼氏小體顯示清晰為宜。無水乙醇進行脫水，二甲苯 Ⅰ、Ⅱ 透明各10 min，滴加中性樹膠封片，顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)。

1.6免疫組織化學法檢測兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中Bcl-2、Bax表達切片置于60 ℃烤箱中烘烤 60 min 后浸入二甲苯中脫蠟，按照體積分數(shù)100%、100%、95%、90%、80%的梯度行乙醇復水，自來水沖洗后滴加H2O2放入濕盒內(nèi)室溫下孵育15 min，去離子水沖洗1次，磷酸鹽緩沖液漂洗3次后行高壓修復抗原，滴加山羊血清封閉液，放入37 ℃恒溫箱中0.5 h，每張切片滴加30 μL Bcl-2、Bax一抗(稀釋比例為1600)，4 ℃冰箱孵育過夜，第2天滴加二抗，行DAB顯色、蘇木精復染、鹽酸乙醇分化，經(jīng)體積分數(shù)80%、95%、100%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，細胞質(zhì)染色呈棕褐色者為陽性細胞，每只兔選取同側(cè)外側(cè)膝狀體的5張不連續(xù)的石蠟切片，每張切片選取2個 50 μm 高倍視野下計數(shù)陽性細胞，陽性細胞率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1慢性高眼壓兔模型制備結(jié)果所有動物實驗期間無意外死亡，眼壓均介于2.93～6.67 kPa，所有高眼壓維持至實驗結(jié)束，無角膜擴張等不良情況發(fā)生。

2.2各組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元形態(tài)正常組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元細胞核呈淡藍色，尼氏小體呈深藍色，細胞大小均勻，排列緊密(圖1A)。損傷組兔外側(cè)膝狀體多數(shù)神經(jīng)元水腫，體積變大，排列疏松，可見較多尼氏小體溶解甚至消失(圖1B)。治療組兔外側(cè)膝狀體部分神經(jīng)元水腫，排列較損傷組緊密，可見較少尼氏小體溶解(圖1C)。

A：正常組兔外側(cè)膝狀體細胞，箭頭所示為正常尼氏小體；B：損傷組兔外側(cè)膝狀體細胞，箭頭所示尼氏小體溶解，自核周崩解為細塵狀顆粒，著色變淺，部分細胞尼氏小體消失；C：治療組兔外側(cè)膝狀體細胞，箭頭所示可見部分尼氏小體溶解呈細顆粒，但細胞著色較損傷組深。

2.3各組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率比較正常組兔外側(cè)膝狀體僅有極少量Bcl-2陽性表達神經(jīng)元(圖2A)。損傷組、治療組兔外側(cè)膝狀體可見較多Bcl-2陽性表達神經(jīng)元(圖2B、圖2C)。正常組、損傷組和治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率分別為(0.47±0.43)%、(11.42±1.92)%、(18.95±2.46)%，3組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=792.91，P<0.01)。損傷組、治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率顯著高于損傷組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：正常組；B：損傷組；C：治療組；箭頭所示為陽性細胞。

2.4各組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bax陽性細胞率比較正常組兔外側(cè)膝狀體僅有極少量的Bax陽性表達神經(jīng)元(圖3A)。損傷組、治療組兔外側(cè)膝狀體可見較多Bax陽性表達神經(jīng)元(圖3B、圖3C)。正常組、損傷組和治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bax陽性細胞率分別為(0.51±0.33)%、(20.28±2.20)%、(12.88±1.96)%，3組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=1 019.11，P<0.01)。損傷組、治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bax陽性細胞率均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bax陽性細胞率顯著低于損傷組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：正常組；B：損傷組；C：治療組；箭頭所示為陽性細胞。

2.5各組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率/Bax陽性細胞率比較正常組、損傷組、治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率/Bax陽性細胞率比值分別為0.67±0.60、0.56±0.10、1.50±0.28，3組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率/Bax陽性細胞率比值比較差異有統(tǒng)計學意義(F=80.96，P<0.01)。損傷組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率/Bax陽性細胞率比值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率/Bax陽性細胞率比值顯著高于正常組及損傷組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討論

青光眼是常見的以視野缺損為特征的不可逆致盲性疾病[6-8]，其致病因素主要為病理性眼壓升高，然而，臨床上某些眼壓控制在正常范圍內(nèi)的青光眼患者，其視野損害仍可進展，對此，有研究者指出，青光眼損害是從視網(wǎng)膜到外側(cè)膝狀體乃至枕葉視皮質(zhì)的一種廣泛性損傷，對青光眼的病程進展及臨床治療的研究也從眼球局部逐漸擴展到了整個視路水平[9]。近年來，青光眼的發(fā)病機制被認為是腦退行性病變的一種，與帕金森等疾病類似，上下級神經(jīng)元是一個聯(lián)系單元，任何神經(jīng)元損傷都會引起相關(guān)聯(lián)神經(jīng)的損傷和凋亡[10]。外側(cè)膝狀體是RGC纖維在視覺傳導通路上投射的重要中繼核團，外側(cè)膝狀體一方面可以因RGC的損傷而繼發(fā)一系列損傷，這種損傷是順行性跨神經(jīng)元變性的結(jié)果，另一方面外側(cè)膝狀體的損傷或退變也逆行性損傷RGC，其機制可能是通過氧化損傷和谷氨酸興奮性毒性所致[11]。所以，在青光眼的研究中，高位中樞外側(cè)膝狀體的研究與保護成為熱點。

以往有關(guān)高眼壓外側(cè)膝狀體的研究顯示，正常外側(cè)膝狀體神經(jīng)元數(shù)量較多，軸突排列為條索狀，細胞著色均勻，隨著高眼壓持續(xù)時間的延長，外側(cè)膝狀體神經(jīng)元損傷逐漸明顯，外側(cè)膝狀體神經(jīng)元數(shù)量與正常組相比明顯減少，出現(xiàn)大量神經(jīng)元的空泡化，細胞內(nèi)可見固縮和碎裂的細胞核，神經(jīng)元軸突數(shù)量減少，軸索走行排列較對照組排列更加混亂沒有規(guī)則[12]。本實驗中正常組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元尼氏小體染色呈深藍色，細胞核呈淡藍色，細胞大小均勻，排列緊密；損傷組造模4周時神經(jīng)元形狀不規(guī)則，出現(xiàn)核固縮及尼氏小體溶解，與以往的研究結(jié)果基本一致[12]；而治療組兔外側(cè)膝狀體部分神經(jīng)元水腫，排列較損傷組緊密，可見較少尼氏小體溶解，提示尼莫地平治療能夠在一定程度上減輕損傷。

慢性高眼壓損傷時，可見視網(wǎng)膜纖維層水腫，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡[13]，通過上下級神經(jīng)纖維的投射，即跨神經(jīng)元變性的原理引起外側(cè)膝狀體神經(jīng)元凋亡。Bcl-2家族蛋白能夠調(diào)控細胞凋亡程序，Bcl-2 可以通過控制Ca2+通道的開放和關(guān)閉，減少Ca2+跨膜運轉(zhuǎn)抑制凋亡，Bax可以與之結(jié)合成 Bcl-2-Bax 異二聚體，對抗Bcl-2的作用促進凋亡[14]。Ca2+拮抗劑可以通過抑制內(nèi)源性Ca2+上調(diào)，阻斷興奮性氨基酸所介導的毒性，從而抑制神經(jīng)元凋亡。尼莫地平是Ca2+通道阻滯劑的代表藥物，其能夠透過血腦屏障，在腦部缺血性疾病的治療中取得了良好效果。青光眼的初始損傷與某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變相似，都是發(fā)生在神經(jīng)節(jié)細胞的軸突末梢。近年來，有研究者在對青光眼患者的評估中發(fā)現(xiàn)，尼莫地平治療患者的眼部病理改變得到明顯改善，由此可以推斷出，尼莫地平對青光眼患者的視神經(jīng)病變具有一定的治療作用[15]。

本研究結(jié)果顯示，正常組兔外側(cè)膝狀體僅有極少量的Bcl-2、Bax陽性表達神經(jīng)元，而損傷組、治療組兔外側(cè)膝狀體可見較多的Bcl-2、Bax陽性表達神經(jīng)元，3組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2、Bax陽性細胞率比較差異均有統(tǒng)計學意義；其中損傷組、治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2、Bax陽性細胞率均顯著高于正常組，提示慢性高眼壓可促進凋亡的發(fā)生，造成外側(cè)膝狀體的損傷；而治療組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率顯著高于損傷組，Bax陽性細胞率顯著低于損傷組，提示尼莫地平可以促進抑凋亡因子Bcl-2的表達，抑制促凋亡因子Bax的表達。另外，3組兔之間外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率/Bax陽性細胞率比值比較差異有統(tǒng)計學意義，其中損傷組兔外側(cè)膝狀體神經(jīng)元Bcl-2陽性細胞率/Bax陽性細胞率比值與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義，可能是由于慢性高眼壓持續(xù)4周時，Bcl-2及Bax表達均增高，提示凋亡狀態(tài)的存在；治療組兔外側(cè)膝狀體Bcl-2陽性細胞率/Bax 陽性細胞率比值顯著高于正常組及損傷組，可能是由于尼莫地平治療后Bcl-2表達增高而Bax表達降低的結(jié)果，提示尼莫地平可以在一定程度上抑制凋亡。

綜上所述，本實驗提示，慢性高眼壓可以引起外側(cè)膝狀體神經(jīng)元的損傷，尼莫地平可在一定程度上促進抑凋亡因子Bcl-2表達，抑制促凋亡因子Bax表達，從而減輕慢性高眼壓所造成的損傷。但本實驗的周期略短，對于其機制是順行的跨神經(jīng)元變性的結(jié)果還是藥物直接作用于外側(cè)膝狀體而發(fā)揮的修復作用，仍需進一步研究和探索。