熊萬成，張玉松，赫 鵬

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，河南 衛(wèi)輝 453100)

便秘可見于任何年齡的人群，主要表現(xiàn)為糞便干硬、排便困難及排便次數(shù)減少(每周少于3次)[1]。慢性傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)是一種常見的便秘類型，屬于功能性腸病[2]。近年來，隨著飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的改變，生活節(jié)奏加快，以及精神壓力增加，功能性便秘的發(fā)病率有上升趨勢。腸道菌群是調(diào)節(jié)腸道功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，菌群紊亂可導(dǎo)致腸道功能異常，出現(xiàn)腹瀉或便秘。本研究對STC患者腸道菌群特點(diǎn)進(jìn)行分析，并探討結(jié)腸次全切除術(shù)的臨床療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2015年1月至2017年1月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科住院的STC患者28例為觀察組，其中男9例，女19例；年齡 43～67(54.0±3.2)歲；病程5～17(9.4±2.1)a。另選擇體檢健康者26例為對照組，其中男8例，女18例；年齡45～69(55.0±2.4)歲。2組受試者的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組：符合STC診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；STC病程≥ 5 a，且反復(fù)保守治療效果不佳；近1個(gè)月內(nèi)未服用微生態(tài)制劑、抗生素及治療便秘藥物；患者及家屬強(qiáng)烈要求手術(shù)，簽署手術(shù)同意書。對照組：無明顯消化道疾病及便秘癥狀；近1個(gè)月內(nèi)未服用微生態(tài)制劑、抗生素及治療便秘藥物。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有腹部手術(shù)史者；因精神心理障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌或代謝疾病及藥物性因素引起的便秘；結(jié)腸、直腸、肛門器質(zhì)性病變。

1.2試劑和儀器糞便DNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，溴化乙錠購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，DNA Marker、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶AluI購自寶生物工程(大連)有限公司；EC3型凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP公司，Nano Drop 2000紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo公司，PTC-200型PCR儀購自美國Bio-Rad公司，恒溫水浴鍋購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，超純水系統(tǒng)購自德國Thermo，超低溫冰箱購自日本SANYO公司，臺式高速低溫離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，電子天平購自上海電子天平儀器廠。

1.3方法

1.3.1治療方法觀察組患者均采用腹腔鏡結(jié)腸次全切除術(shù)治療?；颊呷砺樽?，取截石位，臍下 3 cm 做1 cm橫切口，氣腹針穿刺建立氣腹，置入斜30°鏡。腹腔鏡直視下右下腹置入12 mm套管作為主操作孔，右上腹平臍置入5 mm套管作為輔助操作孔。左側(cè)上、下腹各置入5 mm套管作為副操作孔。沿乙狀結(jié)腸系膜右側(cè)根部腹膜返折處切開進(jìn)入Toldt間隙，并向盆腔延長到直腸膀胱(子宮)陷凹，生物夾夾閉腸系膜動、靜脈并離斷。切開乙狀結(jié)腸系膜左側(cè)根部，游離乙狀結(jié)腸。沿逆時(shí)針方向游離降結(jié)腸及結(jié)腸脾曲，于胃結(jié)腸韌帶解剖游離橫結(jié)腸至結(jié)腸肝區(qū)。打開右結(jié)腸系膜，拓展右側(cè)Toldt間隙，解剖離斷右結(jié)腸血管及中結(jié)腸血管，游離右結(jié)腸至盲腸與升結(jié)腸交界處。取右下腹經(jīng)腹直肌切口，長約8 cm，逐層進(jìn)腹。于腹膜返折上4 cm弧形切割閉合器離斷乙狀結(jié)腸，腸鉗夾閉離斷盲腸上 10 cm 升結(jié)腸。吻合器完成盲直腸吻和。

1.3.2標(biāo)本采集2組受試者留取新鮮糞便標(biāo)本 3～5 g，一部分標(biāo)本放入無菌離心管，另一部分標(biāo)本放入裝有1 mL無菌甘油的離心管中，均于-80°保存。

1.3.3末端限制性片段長度多態(tài)性(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism，T-RFLP)檢測腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)取糞便標(biāo)本0.5 g，采用Tiangen 糞便DNA 提取試劑盒進(jìn)行糞便微生物基因組DNA的提取，按說明書進(jìn)行操作。然后用紫外分光光度計(jì)測定提取到的DNA的濃度。采用細(xì)菌16S rRNA 特異性引物8F/1492R對樣品中的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物8F的5′端帶有羧基熒光素標(biāo)記[4]。采用限制性內(nèi)切酶AluI對純化后的PCR產(chǎn)物在37 ℃恒溫條件下酶切4 h，然后于80 ℃水浴20 min使酶失活，得到帶有標(biāo)記的不同大小的末端片段(terminal restriction fragments，T-RFs)，然后對酶切片段大小進(jìn)行檢測。根據(jù)測序所得T-RFs片段的大小和數(shù)量，用Peak Scanner(v1.0)和Gene Marker 2.20 軟件對其進(jìn)行分析，計(jì)算不同樣品中細(xì)菌的多樣性和豐富度，細(xì)菌的多樣性以香農(nóng)多樣性指數(shù)表示[5]。

1.3.4腸道細(xì)菌豐度檢測取保存于甘油中的糞便標(biāo)本，37 ℃水浴融化后，用無菌槍頭和渦旋儀將糞便在甘油中混勻，系列稀釋樣品到10-4、10-5和10-6，將稀釋后的樣品分別涂布在選擇性培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)乳酸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌、腸桿菌、腸球菌、梭桿菌。每種培養(yǎng)基每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)平板，于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)3～5 d，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5觀察組患者手術(shù)前后排便功能監(jiān)測采用Wexner便秘評分[6]評估排便情況，包括大便次數(shù)、困難程度、排空感等條目，評分越高表示便秘越嚴(yán)重。采用ManoScan 360TM胃腸動力學(xué)檢查系統(tǒng)對觀察組患者術(shù)前及術(shù)后3個(gè)月肛管高壓帶、靜息壓、最大收縮壓和收縮持續(xù)時(shí)間進(jìn)行監(jiān)測。

2 結(jié)果

2.12組受試者腸道細(xì)菌多樣性和豐富度比較結(jié)果見表1。觀察組患者糞便菌群香農(nóng)多樣性指數(shù)和豐富度均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2組受試者香農(nóng)多樣性指數(shù)和菌種豐富度比較

2.22組受試者腸道細(xì)菌豐度比較結(jié)果見表2。觀察組患者腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌及類桿菌的豐度低于對照組，腸桿菌、腸球菌及梭桿菌的豐度高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 2組受試者腸道細(xì)菌豐度比較

2.3觀察組患者手術(shù)前后排便功能比較結(jié)果見表3。觀察組患者術(shù)后3個(gè)月Wexner便秘評分低于術(shù)前，肛管高壓帶、靜息壓、最大收縮壓和收縮持續(xù)時(shí)間高于術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 觀察組28例STC患者手術(shù)前后排便功能比較

注：1 mmHg=0.133 kPa。

3 討論

功能性便秘是指除外腸道或全身器質(zhì)性疾病及藥物性因素所引起的便秘[7-8]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，功能性便秘的發(fā)病原因尚未完全明確，已知其發(fā)病可能與纖維素、水分?jǐn)z入不足、腸道平滑肌肌張力降低、腸蠕動受機(jī)械性阻礙以及排便肌群活動障礙有關(guān)。

腸道微生物是指在腸道這個(gè)特殊微生態(tài)環(huán)境內(nèi)寄居的全部微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒、原生動物等，而細(xì)菌種類最多，可達(dá)1 000～1 150種，其中主要有擬桿菌屬、梭菌、乳桿菌、大腸埃希菌，絕大多數(shù)為厭氧菌，數(shù)量超過1 014，約為人體細(xì)胞的10倍。腸道菌群對宿主的物質(zhì)代謝、消化吸收和免疫防御均可產(chǎn)生影響，且互相制約、互相依存，形成一個(gè)相對穩(wěn)定的生態(tài)平衡，參與機(jī)體的多項(xiàng)生理活動[9]。有研究顯示，菌群紊亂會誘發(fā)和加重排便異常，且慢性便秘患者存在腸道菌群紊亂[10]。

大腸各部位內(nèi)容物和糞便的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，個(gè)體差異較小腸小，適合通過糞便取樣進(jìn)行大腸部位特別是結(jié)直腸的腸道微生態(tài)與某些疾病的相關(guān)分析。本研究采用T-RFLP檢測技術(shù)對糞便細(xì)菌的多樣性和豐富度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)STC患者糞便細(xì)菌多樣性和豐富度均顯著降低。觀察組患者腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌數(shù)量少于對照組，腸桿菌、腸球菌、梭桿菌多于對照組。腸道微生態(tài)參與便秘發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚不清楚，但在乳酸桿菌、雙歧桿菌等腸道優(yōu)勢菌群中，雙歧桿菌可酵解寡糖等產(chǎn)生醋酸和乳酸，使糞便連續(xù)不斷地推向肛門，促進(jìn)腸道運(yùn)動，促使大便排出體外。而在腸道菌群平衡被打破后，雙歧桿菌等常住厭氧菌數(shù)量減少時(shí)，大腸中可大量堆積難以消化的寡糖，進(jìn)而導(dǎo)致患者出現(xiàn)便秘、腹脹等癥狀。

對于癥狀嚴(yán)重、病程長、保守治療效果不佳的STC患者，結(jié)腸次全切除是較為有效的治療手段。本研究顯示，結(jié)腸次全切除術(shù)后患者便秘癥狀明顯改善，Wexner便秘評分顯著降低，肛管高壓帶、靜息壓、最大收縮壓和收縮持續(xù)時(shí)間顯著升高。結(jié)腸次全切除術(shù)的優(yōu)勢包括：(1)保留盲腸，有助于控制食糜進(jìn)入結(jié)腸的速度和正常糞便形成，且保留了制造短鏈脂肪酸的結(jié)腸菌群和未消化的淀粉，有助于維持維生素、電解質(zhì)和正常水分的吸收；(2)該術(shù)式可切除最為顯著的Cajal間質(zhì)細(xì)胞部分，效果顯著，患者接受度高[11]。

綜上所述，STC患者的結(jié)腸菌群紊亂，菌群多樣性和豐富度均顯著降低。結(jié)腸次全切除術(shù)可有效改善STC患者的臨床癥狀，可作為STC患者的有效外科治療手段之一，但其遠(yuǎn)期效果有待于進(jìn)一步隨訪觀察。