肖慧玉，李秀杰，陳菲凡，李 靜，張非凡，劉麗紅，于德欽，李樹壯

(大連醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

近年來，隨著工業(yè)發(fā)展，機(jī)械性創(chuàng)傷(mechanical trauma, MT)引起了人們的廣泛關(guān)注。國家統(tǒng)計(jì)局官方數(shù)據(jù)表明，2015年中國發(fā)生交通事故187 781起，其中死亡率高達(dá)30%。心臟作為人類生存的重要器官之一，MT可以引起心肌細(xì)胞凋亡[1]，進(jìn)而引發(fā)的繼發(fā)性心功能障礙嚴(yán)重影響受傷患者的生命和生活質(zhì)量[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)TNF-α的過量產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和Ca2+濃度變化都會(huì)導(dǎo)致心肌繼發(fā)性損傷。凋亡細(xì)胞在創(chuàng)傷后一段時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間的延長而增多[3]，因此臨床上盡早采取措施阻斷細(xì)胞凋亡具有重要意義。

白楊素(chrysin)是一種天然黃酮類化合物，它主要存在于蜂膠和西番蓮屬植物中。大量研究表明，白楊素可以促使TNF-α介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制病態(tài)血管形成從而發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。白楊素還具有多種生物活性，如抑制細(xì)胞增殖[5]和抗高血壓[6]。本研究旨在闡明白楊素在TNF-α和活性氧(reactive oxygen species, ROS)介導(dǎo)MT中能否抑制心肌細(xì)胞凋亡和發(fā)揮心臟保護(hù)功能，并對(duì)其潛在的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠20只，雄鼠，體質(zhì)量180～220 g[大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證：SCXK(遼)2008- 0002]。

1.1.2 主要試劑：大鼠心肌細(xì)胞系(H9c2)、人單核細(xì)胞系(THP- 1)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；白楊素(大連美侖有限公司，單體純度：99.3%)；TNF-α(Sigma-Aldrich公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT 細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和ROS 檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；Fluo4-AM(Dojindo同仁化學(xué)研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠分組及處理：將大鼠分為對(duì)照組、創(chuàng)傷組(參照制備MT模型文獻(xiàn)[7])、創(chuàng)傷給藥組(創(chuàng)傷前0.5 h腹腔注射白楊素溶液20 mg/kg)和創(chuàng)傷溶劑組(創(chuàng)傷前0.5 h腹腔注射與藥物溶液等體積的DMSO)，每組5只，先后進(jìn)行在體和離體實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測：創(chuàng)傷后12 h，麻醉大鼠，沿右頸總動(dòng)脈插管(PE50)至左心室，用TM_WAVE系統(tǒng)記錄左心室心功能參數(shù)：左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dP/dTmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dP/dTmax)等指標(biāo)。計(jì)算左心室發(fā)展壓(LVDP=LVSP-LVEDP)，并對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：H9c2細(xì)胞：DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10% 胎牛血清,4 mmol/L谷氨酰胺,105U/L青鏈霉素，細(xì)胞鋪于平皿內(nèi)，在37 ℃含5% CO2的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。2～3 d換液，細(xì)胞增殖至匯合度為70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代至7～13代間，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期時(shí)，進(jìn)行試驗(yàn)。THP- 1細(xì)胞采用1640培養(yǎng)基，其余步驟同上。

不同濃度白楊素對(duì)正常H9c2 細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組和給藥組?？瞻捉M只需加MTT，對(duì)照組不做特殊處理，給藥組在加入MTT之前給予含有0.1%不同藥物濃度的培養(yǎng)基處理。TNF-α作用下不同濃度白楊素對(duì)細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組、TNF-α組和白楊素藥物保護(hù)組。ELISA檢測TNF-α：在體實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、創(chuàng)傷組、創(chuàng)傷藥物干預(yù)組和創(chuàng)傷溶劑組(n=5)；離體實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、脂多糖LPS組、LPS+藥物干預(yù)組和LPS藥物溶劑組；THP- 1細(xì)胞對(duì)照組不予特殊處理；LPS組為THP- 1細(xì)胞中加入LPS(1 mg/L)；藥物干預(yù)組和溶劑組為藥物和溶劑作用0.5 h后，再加入LPS(1 mg/L)。ROS的檢測實(shí)驗(yàn)中THP- 1細(xì)胞分組及處理同ELISA檢測TNF-α的離體實(shí)驗(yàn)；H9c2貼壁細(xì)胞樣本分為對(duì)照組、TNF-α組、TNF-α+藥物干預(yù)組、TNF-α溶劑組,藥物和溶劑組作用0.5 h后，加入TNF-α(10 μg/L)。

1.2.4 細(xì)胞存活率的檢測：用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率。細(xì)胞活力/%=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。TNF-α作用下不同濃度白楊素對(duì)細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)在加入MTT前，每孔加入TNF-α(10 μg/L)，孵育12 h，其余步驟同上。

1.2.5 原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡：術(shù)后24 h取左心室壁心肌組織，4%多聚甲醛常溫固定包埋，制成冰凍切片，后續(xù)步驟按說明書進(jìn)行。計(jì)算時(shí)每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,每視野計(jì)數(shù) 100個(gè)細(xì)胞,以TUNEL染色陽性的凋亡細(xì)胞占所有被計(jì)數(shù)的心肌細(xì)胞的百分比作為凋亡指數(shù)。

1.2.6 ELISA檢測TNF-α：創(chuàng)傷完畢1.5 h后，麻醉大鼠，取心尖血1.5 mL于離心管(事先加入1%肝素50 μL)中，室溫靜置30 min，離心，取上清，ELISA檢測TNF-α。操作參照試劑盒說明書。在450 nm下測量A值，計(jì)算出樣品濃度。

1.2.7 ROS的檢測：THP- 1細(xì)胞處理12 h后，按說明裝載探針，各組分別收集離心，取上清，用熒光酶標(biāo)儀488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長檢測熒光強(qiáng)度。裝載DFCH-DA活性氧探針，測定各組活性氧的A值。H9c2 細(xì)胞處理6 h后按上述步驟檢測。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度：激光共聚焦顯微鏡下以494 nm波長激發(fā),516 nm波長發(fā)射，使用油鏡，放大倍數(shù)為63倍，觀察大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。每隔10 s拍攝圖像，記錄15 min。得到的細(xì)胞鈣熒光圖像用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白楊素對(duì)創(chuàng)傷后大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

本組前期工作發(fā)現(xiàn)，隨著創(chuàng)傷程度增大，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目也逐漸增加，而200 r/min能造成大鼠非致死性且比較理想的創(chuàng)傷，故用此于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組和創(chuàng)傷組大鼠的心室舒縮功能見圖 1所述。

相比于對(duì)照組，創(chuàng)傷組LVDP、MAP、+dP/dTmax和-dP/dTmax均明顯下降(P<0.01)，在給予白楊素后心功能各指標(biāo)較創(chuàng)傷組明顯上升(P<0.01)(圖 1)。

2.2 白楊素對(duì)創(chuàng)傷后心肌組織細(xì)胞凋亡的影響

創(chuàng)傷組、創(chuàng)傷給藥組和創(chuàng)傷溶劑組凋亡指數(shù)與對(duì)照組相比均明顯升高(P<0.01)。與創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷給藥組凋亡指數(shù)明顯下降(P<0.01)(圖 2)。

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確定白楊素藥物濃度

20、40和80 μmol/L的白楊素藥物濃度作用下細(xì)胞存活率分別下降了3%、7%和15%(圖 3)。與對(duì)照組相比，TNF-α組的細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01),各個(gè)藥物干預(yù)組細(xì)胞存活率均上升(P<0.01)(圖 4)。對(duì)正常心肌細(xì)胞沒有毒性且在創(chuàng)傷因子TNF-α誘導(dǎo)下又對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用的白楊素藥物濃度為10 μmol/L。

2.4 白楊素對(duì)單核細(xì)胞和細(xì)胞系THP-1 TNF-α釋放的影響

在體實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，創(chuàng)傷組血漿中TNF-α的水平明顯上升(P<0.01)，但創(chuàng)傷給藥組TNF-α的含量較創(chuàng)傷組明顯下降(P<0.01)(圖5A)。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果與在體實(shí)驗(yàn)一致(圖5B)。

2.5 白楊素對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

在LPS刺激THP- 1創(chuàng)傷模型中，與對(duì)照組相比，LPS組ROS熒光強(qiáng)度顯著上升(P<0.01)。LPS+白楊素組與LPS組相比ROS含量明顯下降(P<0.01)(圖 6A)。

在TNF-α刺激H9c2創(chuàng)傷模型中，結(jié)果與上述一致(圖 6B)。

*P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with trauma group圖1 白楊素對(duì)創(chuàng)傷后大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Fig 1 Effect of chrysin on hemodynamic parameters following MT-induced myocardial injury

圖2白楊素對(duì)創(chuàng)傷后心肌組織細(xì)胞凋亡的影響
Fig2EffectofchrysinontheapoptosisofcardiacmusclecellsfollowingMT-inducedinjury

2.6 白楊素對(duì)創(chuàng)傷引起的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響

創(chuàng)傷組和創(chuàng)傷溶劑組，較對(duì)照組明顯上升(P<0.01)，而創(chuàng)傷給藥組與創(chuàng)傷組相比，Ca2+濃度明顯下降(P<0.01)(圖7)。

3 討論

隨著當(dāng)今的醫(yī)療衛(wèi)生條件的逐年提升，創(chuàng)傷造成的直接性損傷可以得到很好的控制，但創(chuàng)傷后造成的MODS已經(jīng)成為影響創(chuàng)傷病人生存率和生活質(zhì)量的主要因素[8]。因此， 尋找預(yù)防治療繼發(fā)性損傷的藥物是亟待解決的問題。

*P<0.05,#P<0.01 compared with control group圖3 不同濃度白楊素作用下H9c2細(xì)胞的存活率Fig 3 Viability of H9c2 cells in different chrysin levels

*P<0.01 compared with control cells; #P<0.01compared with TNF-α-treated cells圖4 TNF-α誘導(dǎo)不同濃度白楊素作用下H9c2細(xì)胞的存活率Fig 4 Viability of TNF-α-induced H9c2 cells in different chrysin n=5)

A.effect of chrysin on TNF-α levels in plasma of trauma group;*P<0.01 compared with control;#P<0.01 compared with trauma group; B.effect of chrysin on LPS-induced TNF-α levels in THP- 1 cells;*P<0.01 compared with control cells;#P<0.01 compared with LPS-treated cells

A:fluorescence intensity in LPS-induced THP- 1 cells,*P<0.01 compared with control cells,#P<0.01 compared with LPS-treated cells; B:fluorescence intensity in LPS-induced H9c2 cells,*P<0.01 compared with control cells,#P<0.01 compared with LPS-treated cells

A.confocal image (×63 objective, NA1.4, oil immersion)showing Ca2+labeling; B.Ca2+fluorescence intensity of each group;*P<0.01 compared with control;#P<0.01 compared with LPS-treated cells

在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MT后給予白楊素，心功能指標(biāo)明顯上升，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降，表明白楊素能夠有效改善心功能紊亂。大量的實(shí)驗(yàn)證明TNF-α是引起風(fēng)心病[9]和慢性心衰竭[10]等心功能紊亂的關(guān)鍵因素。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)MT后引起心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子也是TNF-α，其中的主要機(jī)制為caspase- 8和caspase- 3的激活，以及ROS的大量產(chǎn)生[11]，心肌細(xì)胞凋亡后進(jìn)而導(dǎo)致心功能紊亂。本研究表明白楊素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)下細(xì)胞的存活起保護(hù)作用。ELISA檢測結(jié)果顯示：與其它組相比，藥物干預(yù)組TNF-α釋放顯著降低；熒光檢測結(jié)果顯示：藥物干預(yù)組較其它組ROS的產(chǎn)生明顯減少。提示白楊素能抑制TNF-α釋放、ROS的產(chǎn)生從而減少心肌細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激與細(xì)胞內(nèi)Ca2+的相互關(guān)系對(duì)心肌損傷的影響也是非常重要的。在本次實(shí)驗(yàn)中機(jī)械創(chuàng)傷可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，而白楊素可以降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增多。而其中的機(jī)制是因?yàn)榘讞钏鼐哂芯徑忖}超載和抗氧化應(yīng)激的作用[12]。

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用H9c2細(xì)胞系和THP- 1細(xì)胞系代替整體動(dòng)物分離的細(xì)胞，是因?yàn)檎w動(dòng)物分離得到的心肌細(xì)胞受技術(shù)和操作等方面的影響更大，穩(wěn)定性不如H9c2細(xì)胞系?；谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)，TNF-α主要來自單核細(xì)胞。因此本實(shí)驗(yàn)采用THP- 1細(xì)胞系，便于研究TNF-α的釋放。

綜上所述，白楊素可以通過抗氧化作用和降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載來改善TNF-α介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮創(chuàng)傷后心臟保護(hù)的作用，這為臨床防治機(jī)械性創(chuàng)傷導(dǎo)致的繼發(fā)性心肌損傷和MODS提供新的研究策略。但是對(duì)于氧化應(yīng)激相關(guān)分子機(jī)制探討還存在一定的局限性，仍需要進(jìn)一步的工作來深入探討。