表達綠色熒光蛋白的重組海分枝桿菌的構(gòu)建

劉梓健，彭寶洲，粟海波

（廣州醫(yī)科大學(xué)-廣州生物醫(yī)藥與健康研究院聯(lián)合生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 511436）

結(jié)核病（tuberculosis，TB）由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起，是所有疾病中最致命的傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2017年結(jié)核病仍然是全世界最具威脅性的細菌感染病，死亡人數(shù)多達170萬人，全球約有1/4的人口有結(jié)核分枝桿菌潛伏感染[1-2]?？ń槊纾˙CG）疫苗作為唯一全球廣泛使用的疫苗，不足以防治Mtb感染。目前，多種新疫苗保護效果不能完全令人滿意。并且隨著越來越多的Mtb菌株對現(xiàn)有抗結(jié)核藥物產(chǎn)生抗藥性，防治TB非常嚴峻[3-5]。因此，根據(jù)之前的不足，研究結(jié)核病發(fā)病機制以及尋找新型、高效結(jié)核疫苗，防治結(jié)核病有著重大的意義。

直接研究Mtb影響了抗結(jié)核藥物研發(fā)的效率。由于海分枝桿菌（Mycobacterium Marinum，M.Marinum）與MTB的基因相似性高達95%以上，且其生長更快、毒力更小、傳染性更低，研究可在二級生物實驗室內(nèi)進行，因而M.Marinum是研究Mtb的優(yōu)良模式病原[6]。

綠色熒光蛋白（Green Fluorescence Protein，GFP）由GFP基因編碼，在近紫外或藍光激發(fā)時就能輻射出綠色熒光，因而GFP常常作為分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)中用于示蹤和定量的研究工具[5,7]。

本研究中，將增強型綠色熒光蛋白基因（EGFP）克隆到海分枝桿菌的表達載體pMV261，利用EGFP為示蹤基因標記M.Marinum，有利于后續(xù)觀察其基因表達調(diào)控，將對研究TB發(fā)病機制以及研制新型結(jié)核疫苗有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

pMV261質(zhì)粒；pEGFP-N1細菌；引物P1（5'-GGGGTACCAGCTCAAGCTTCGAATTCTGC-3'）和 P2（5'-CCATCGATACCTCTACAAATGTGGTAT GGCT-3'），下畫線部分分別為kpnⅠ和ClaⅠ酶切位點，由上海生物工程有限公司合成；kanamycin sulfate、限制性內(nèi)切酶ClaⅠ和kpnⅠ購自上海生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Takara；Hot Start Taq 2× Master Mix購 自 BioLabs；T4DNA連接酶、DH5α感受態(tài)細胞、質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN；電擊杯購自BIORAD。

1.2 方法

1.2.1 增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的擴增

質(zhì)粒pEGFP-N1為模版，P1和P2為引物，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：Taq 2× Master Mix 25 μL，引物P1和P2各1 μL，pEGFP-N1質(zhì)粒1 μL，超純水22 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；再分別95 ℃變性 30 s、56 ℃復(fù)性 1 min、68 ℃延伸 1 min，30個循環(huán)；最后68 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒回收和純化，并取適量樣品用1.5%瓊脂糖凝膠進行鑒定。

1.2.2 含有EGFP基因重組表達質(zhì)粒pMV261-EGFP的構(gòu)建

將回收純化的PCR產(chǎn)物用kpnⅠ和ClaⅠ雙酶切并用DNA純化試劑盒純化回收。pMV261質(zhì)粒用kpnⅠ和ClaⅠ雙酶切后，用1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，并且進行膠回收。酶切產(chǎn)物分別回收后，利用T4DNA連接酶于4 ℃連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α后，涂布于含0.1% kanamycin sulfate的LB瓊脂平板。37℃培養(yǎng)過夜，挑取抗性菌落，并搖菌擴培。

1.2.3 pMV261-EGFP重組質(zhì)粒的鑒定

從含有pMV261-EGFP的大腸桿菌中提取質(zhì)粒。以P1和P2為引物，利用PCR技術(shù)擴增重組質(zhì)粒上的目的基因，再通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。鑒定成功后，通過測序鑒定目的基因序列。

1.2.4 海分枝桿菌的電感受態(tài)細胞的制備和電轉(zhuǎn)化

將海分枝桿菌接種于10 mL 7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，離心收集細菌。先后分別用10 mL、2 mL冰冷的10%甘油滅菌水溶液冰浴2 h，離心棄上清。500 μL的10%甘油重懸細胞后，分裝制成多管海分枝桿菌的電感受態(tài)細胞，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?00 μL海分枝桿菌的電感受態(tài)細胞中加入5 μL重組質(zhì)粒pMV261-EGFP，混勻，移入0.2 mm的電擊杯，冰浴放置10 min。利用電擊杯儀進行電轉(zhuǎn)化。反應(yīng)條件：電阻1 000 Ω，電壓2.5 kV，電容25 μF，轉(zhuǎn)化時間17 ms。電轉(zhuǎn)后立即將細菌轉(zhuǎn)入10 mL 7H9液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)4 h。離心收集菌體，立即涂布于含0.1%kanamycin sulfate的7H10瓊脂平板。37 ℃培養(yǎng)3天。挑取卡那霉素抗性的單菌落，分別接種于5 mL含0.1%kanamycin sulfate的7H9液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng) 3 天[7]。

1.2.5 Western blot檢測重組質(zhì)粒EGFP蛋白的表達

裂解適量細胞后，上清中取4 μL待測蛋白加入到1 μL 4×上樣緩沖液。95 ℃變性5 min后，先后進行12% SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫搖床封閉2 h。TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。室溫下分別用anti-GFP一抗和anti-Rv21453一抗孵育PVDF膜，4 ℃過夜孵育。孵育后，洗膜3次，每次10 min。再與羊抗小鼠IgG二抗室溫下孵育1 h。洗膜3次，每次10 min。最后化學(xué)發(fā)光顯色。

1.2.6 海分枝桿菌感染THP-1吞噬細胞模型建立

感染時按細菌∶細胞=10∶1的比例，取適量細菌懸液加入已經(jīng)貼壁培養(yǎng)的THP-1細胞六孔板中，37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1天。制備感染海分枝桿菌的THP-1巨噬細胞標本，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果分析

2.1 EGFP基因的擴增結(jié)果

EGFP純化后，在1.5%的瓊脂糖凝膠下電泳，在約700 bp處可見1條特異DNA條帶，如圖1所示。預(yù)期大小約為717 bp，擴增結(jié)果與預(yù)期相符。

圖1 EGFP基因PCR擴增結(jié)果

2.2 pMV261-EGFP重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

連接產(chǎn)物用引物P1、P2進行PCR擴增。結(jié)果與預(yù)期的大小相符，在約700 bp處有一條特異DNA條帶（圖2），對陽性克隆重組質(zhì)粒pMV261-EGFP進行序列測定，目的基因序列與預(yù)期的一致，說明重組質(zhì)粒pMV261-EGFP構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pMV261-EGFP PCR鑒定結(jié)果

2.3 Western blot檢測結(jié)果

Western blot結(jié)果表明，海分枝桿菌內(nèi)EGFP蛋白表達，印跡出現(xiàn)位置約為25 kDa處，如圖3所示。

圖3 Western blotting結(jié)果

2.4 重組海分枝桿菌的證實

構(gòu)建海分枝桿菌感染TPH-1巨噬細胞模型，并制備成相應(yīng)的標本，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見TPH-1巨噬細胞內(nèi)有釋放綠色熒光的海分枝桿菌（圖4），故海分枝桿菌感染TPH-1巨噬細胞模型構(gòu)建成功，證實轉(zhuǎn)化pMV261-EGFP的重組海分枝桿菌構(gòu)建成功。

圖4 重組結(jié)核分枝桿菌的熒光鑒定

3 討論

耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）的流行以及廣泛耐藥結(jié)核?。╔DR-TB）的出現(xiàn)，導(dǎo)致多種候選疫苗在抗結(jié)核潛伏感染臨床保護效果及運用前景方面尚不能完全令人滿意，這也表明人類結(jié)核病正在加入抗生素后時代的細菌性疾病。TB對人類健康的持續(xù)造成威脅，對全球結(jié)核病疾病控制帶來了巨大挑戰(zhàn)。尋求新型、安全、高效的抗結(jié)核藥物是一個重要的研究課題[4-5]。結(jié)合之前對防治TB的研究，再次研究結(jié)核發(fā)病機制以及研制新型疫苗是有必要及可行的。

由于Mtb生長緩慢，而且受到其生物安全性的極大制約，故制約了對細菌致病性研究以及抗結(jié)核藥物研發(fā)的效率。M.Marinum生長更快、毒力更小、傳染性更低，對實驗環(huán)境條件要求較低，便于后續(xù)通過構(gòu)建斑馬魚海分枝桿菌模型進行基礎(chǔ)研究。

增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作為報告基因，它具有多方面的優(yōu)點。（1）它易于構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化后細胞也可以繼續(xù)傳代。（2）作為熒光標記分子，熒光的產(chǎn)生不需要任何外加底物，酶或其他共反應(yīng)因子，熒光穩(wěn)定。因而其表達與激光共聚焦顯微鏡結(jié)合，可方便觀察轉(zhuǎn)染后細胞的增殖和分化等生理功能變化[5,7-10]。

本研究中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMV261-EGFP，并使該重組質(zhì)粒pMV261-EGFP在M.Marinum中穩(wěn)定存在并表達，成功獲得可自發(fā)釋放熒光的M.Marinum。這將便于后續(xù)研究MTB的基因表達調(diào)控、結(jié)核病發(fā)病機制以及研制新型結(jié)核疫苗，以期對結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)、成功治療和有效的預(yù)防有更新發(fā)現(xiàn)。