CIK細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力及殺瘤效應(yīng)

王欣言

（中源協(xié)和生物細(xì)胞存儲(chǔ)服務(wù)（天津）有限公司，天津，300384）

CIK細(xì)胞是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)性細(xì)胞。該種細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)，具有增殖能力強(qiáng)、殺瘤活性高、殺瘤普廣等特點(diǎn)，被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。［1］本實(shí)驗(yàn)從正常志愿者外周血分離單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，研究其在體外的增值規(guī)律、細(xì)胞表型變化以及殺瘤活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于以色列BI公司，IL-2、IFN購(gòu)自廈門特寶生物股份有限公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰綜D3mAb細(xì)胞因子購(gòu)自Biolegend公司，CD3-FITC、CD8-PE、CD56-PE、IgG1-PE、IgG1-FITC以 及 流式細(xì)胞儀分別購(gòu)自美國(guó)BD公司，K562為本實(shí)驗(yàn)室保存和傳代培養(yǎng)。

1.2 PBMC細(xì)胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)

取正常志愿者外周血100mL加入生理鹽水1∶1稀釋后用吸管將血液混合物沿管壁緩慢地加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液之上，于500g、19℃，離心23min。用吸管小心吸取第二層白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層于離心管內(nèi)，加入生理鹽水于300g、19℃、離心5min洗滌2次后調(diào)整細(xì)胞濃度1.0×106/mL。接種于提前包被好CD3單抗的T175培養(yǎng)瓶，加入血清、IL-2、IFN-γ放置于37℃，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。隔天補(bǔ)加培養(yǎng)基、血清、IL-2，觀察細(xì)胞狀態(tài)，計(jì)數(shù)。

1.3 CIK細(xì)胞表型檢測(cè)

分別取誘導(dǎo)前的單個(gè)核細(xì)胞和培養(yǎng)至第13天CIK細(xì)胞1×106，離心去上清，用600μL PBS重懸。每次6只流式管，每只流式管內(nèi)加入100μL細(xì)胞懸液分別標(biāo)記帶熒光的單克隆抗體（CD3-FITC）+（IgG1-PE）、（CD8-PE）+（IgG1-FITC）、（CD56-PE）+（IgG1-FITC）、（CD3-FITC）+（CD56-PE）、（CD3-FITC）+（CD8-PE）、（IgG1-FITC）+（IgG1-PE）為陰性對(duì)照，室溫避光20min后PBS離心洗滌，每管加入200μLPBS重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 殺瘤活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562腫瘤細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度5×104/mL，加于96孔板，每孔加100μL。取培養(yǎng)至13天的CIK細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，使效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1，每孔加100μL，每組取3復(fù)孔，此為實(shí)驗(yàn)組。另設(shè)空白對(duì)照組、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組、靶細(xì)胞對(duì)照組，至于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。取出后加入20μL CCK-8孵育4h后用酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)OD值，參比波長(zhǎng)620nm，測(cè)3次取平均值。殺瘤活性=[1-（實(shí)驗(yàn)組-效應(yīng)對(duì)照組）/（靶細(xì)胞對(duì)照組-空白對(duì)照組）]×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞增值情況

懸浮的單個(gè)核細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞明亮，邊緣規(guī)則成圓形。在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，細(xì)胞成集落生長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)快速?gòu)?fù)制增殖如圖1所示，細(xì)胞數(shù)見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，細(xì)胞增殖較快，呈對(duì)數(shù)增殖，16天達(dá)到增殖高峰。

表1 CIK細(xì)胞體外增殖情況

表2 CIK細(xì)胞的表型分析（ ±s）

表2 CIK細(xì)胞的表型分析（ ±s）

組別 CD3+ CD8+ CD56+ CD3++CD8+ CD3++CD56+PBMC 67.23±3.31 43.61±5.20 22.34±3.30 31.25±0.23 8.85±1.04 CIK 99.00±4.00 73.57±2.42 24.35±3.29 89.28±0.19 21.73±0.90

圖1 成集落生長(zhǎng)的CIK細(xì)胞

2.2 CIK細(xì)胞表型檢測(cè)

從表2中可以看出，誘導(dǎo)培養(yǎng)16天后的CIK主要效應(yīng)細(xì)胞CD3++CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例與未經(jīng)誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞大幅上升（P＜0.05）。

2.3 CIK細(xì)胞的殺瘤活性

如表3，培養(yǎng)至13天時(shí)，CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性隨著效靶比的增大而逐漸增強(qiáng)（P＜0.05）。

表3 CIK細(xì)胞的殺瘤活性

3 討論

惡性腫瘤是一類嚴(yán)重危險(xiǎn)人類健康的常見(jiàn)病，發(fā)病幾乎可以遍及人體的各個(gè)部位、組織、器官。手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療惡性腫瘤的方法很難從根本上完全治愈腫瘤。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展和對(duì)腫瘤發(fā)生分子機(jī)制的深入研究，生物治療已經(jīng)成為腫瘤綜合治療的第四種模式。雖然現(xiàn)在該治療模式尚不能替代三大傳統(tǒng)手段，仍然處于輔助治療地位，但其在提高手術(shù)、放化療療效以及延長(zhǎng)患者生存期、改善生活質(zhì)量方面已經(jīng)受到了越來(lái)越多的關(guān)注[2]。

CIK細(xì)胞是將人外周血或人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2和CD3單抗等誘導(dǎo)而得到的一群異質(zhì)細(xì)胞。增殖速度快，在16天左右達(dá)到增殖高峰，之后增殖速度明顯下降，細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期。CIK細(xì)胞是以CD3++CD56+T細(xì)胞為主要的效應(yīng)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后培養(yǎng)至16天，流式表型分析發(fā)現(xiàn)，CD3++CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例與未經(jīng)誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞相比大幅上升。培養(yǎng)至16天的CIK細(xì)胞殺瘤活性強(qiáng)，其殺瘤活性隨著效靶比的增加而增強(qiáng)。目前的研究CIK細(xì)胞主要通過(guò)3種途徑發(fā)揮殺瘤、溶瘤作用：（1）CIK細(xì)胞通過(guò)釋放顆粒酶／穿孔酶等毒性顆粒，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的裂解；（2）CIK細(xì)胞釋放的大量細(xì)胞因子（如干擾素γ、腫瘤壞死因子α、IL-2等）不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，還可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)性直接殺傷腫瘤細(xì)胞；（3）CIK細(xì)胞能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。CIK細(xì)胞表FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。

CIK細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞免疫治療推上了一個(gè)新的高點(diǎn)。CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤的強(qiáng)細(xì)胞毒性和低毒副作用，為惡性腫瘤的治療提供了新的手段，但在CIK細(xì)胞治療的發(fā)展過(guò)程中，還有很多問(wèn)題亟待解決。尋求提高CIK細(xì)胞治療效果的有效方法，依然是目前研究的關(guān)注點(diǎn)；此外，CIK細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制尚未完全明確，治療方法也需要統(tǒng)一的規(guī)范。