中華稻蝗血細(xì)胞分裂相的研究方法初探

王耀，張小民

（1.晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030600；2.山西大學(xué)，山西太原 030006）

1 研究概況

1.1 對(duì)中華稻蝗的研究現(xiàn)狀

中華稻蝗[Oxya chinensis(Thunb.)]是直翅目斑腿蝗科的一種非遷飛性昆蟲(chóng)，同一科內(nèi)有約9000種，我國(guó)有記載的有300余種，科內(nèi)共有稻蝗屬約20種，我國(guó)約有10種，分布以中華稻蝗最廣。中華稻蝗在我國(guó)華東、華中、華南、華北及東北等地均有分布，多棲憩在禾本科植物的莖葉上，并以此為食，例如水稻、高粱、玉米等作物多受其害。在山西省，中華稻蝗主要分布于晉北、晉中和晉南的低洼、潮濕地帶，該區(qū)是全省水稻的主要種植區(qū)。這一生態(tài)系統(tǒng)中，中華稻蝗是山西省水稻的主要害蟲(chóng)，占了蝗蟲(chóng)總量的90%。

1.2 蝗蟲(chóng)血細(xì)胞研究概況

對(duì)于蝗蟲(chóng)血細(xì)胞的研究雖然開(kāi)始較早，但大部分是注重形態(tài)研究與分類(lèi)學(xué)的研究。對(duì)于蝗蟲(chóng)血細(xì)胞功能、特性的研究較少，但近年來(lái)也逐漸為人所關(guān)注。比如，（1）昆蟲(chóng)造血器官和造血干細(xì)胞的研究，昆蟲(chóng)的造血器官是指產(chǎn)生血細(xì)胞的囊狀結(jié)構(gòu)，一些干細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞聚集而成，網(wǎng)狀細(xì)胞包圍在造血干細(xì)胞周?chē)?，并保護(hù)干細(xì)胞誘導(dǎo)其分化。（2）昆蟲(chóng)血細(xì)胞功能的研究，蝗蟲(chóng)血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和分類(lèi)的研究長(zhǎng)期混亂，嚴(yán)重影響了其他方面工作的深入，對(duì)血細(xì)胞功能方面的研究至今處于初級(jí)階段，多屬于推論，有些由于實(shí)驗(yàn)證據(jù)不足或?qū)嶒?yàn)手段陳舊而未被進(jìn)一步證實(shí)。另外，由于昆蟲(chóng)血細(xì)胞形態(tài)多樣和中間類(lèi)型的存在，即使是同一種昆蟲(chóng)，在不同蟲(chóng)態(tài)、不同蟲(chóng)齡及不同生態(tài)、生理時(shí)都會(huì)發(fā)生變異。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)蝗蟲(chóng)體液中有許多死亡或凋亡的細(xì)胞，以及器官或組織中脫落的非細(xì)胞物質(zhì)，同時(shí)又沒(méi)有使用相同的染色方法，因此對(duì)每種血細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征沒(méi)有嚴(yán)格統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。用于命名每種細(xì)胞類(lèi)型的術(shù)語(yǔ)對(duì)于一種或另一種昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)是經(jīng)常有所不同，比如漿血胞的細(xì)胞質(zhì)中有沒(méi)有顆粒目前說(shuō)法不一，在大多數(shù)鱗翅目種類(lèi)中，漿血胞缺乏顆粒[1]，但在蠟蛾中包含顆粒[2]；又如漿血胞的吞噬作用是有爭(zhēng)議的，有一些學(xué)者認(rèn)為它們是吞噬細(xì)胞[3]，而另一些學(xué)者認(rèn)為它們明顯不是吞噬細(xì)胞[4]，故其形態(tài)也是有爭(zhēng)議的，如有沒(méi)有偽足等結(jié)構(gòu)；又如在果蠅中被稱(chēng)為漿血胞的血細(xì)胞，與鱗翅目中的漿血胞不同，它們有不同的組織和細(xì)胞學(xué)特征，在單層血涂片中有不同的行為和不同的功能[5]；又如粒細(xì)胞的主要功能之一是吞噬，這已被許多的學(xué)者在昆蟲(chóng)體內(nèi)和體外觀察到，果蠅沒(méi)有真正的血細(xì)胞，但是果蠅中的漿血胞比鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)的漿血胞更像粒細(xì)胞[5]，鱗翅類(lèi)的粒細(xì)胞和果蠅的漿血胞也被Nardi[6]和Ling[7]所強(qiáng)調(diào)；又如象鱗翅類(lèi)的類(lèi)絳色血細(xì)胞一樣，在果蠅晶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的包涵體是沒(méi)有膜包被的[8]。晶細(xì)胞中別的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器，有與鱗翅類(lèi)絳色血細(xì)胞相同的特征。此外，由于他們的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征，它們?cè)隗w外的行為和多酚氧化酶等，不同的學(xué)者已經(jīng)將黑腹果蠅的晶細(xì)胞闡述為類(lèi)絳色血細(xì)胞[9]，他們還建議用類(lèi)絳色血細(xì)胞替代晶細(xì)胞。此外，鱗翅類(lèi)[10]和果蠅[11]的類(lèi)絳色血細(xì)胞似乎來(lái)源于造血器官。到目前為止，珠血細(xì)胞存在于所有研究的鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)中，這些細(xì)胞也在果蠅幼蟲(chóng)的最后階段觀察到，但絕不能與真正的珠血細(xì)胞相混。

對(duì)于昆蟲(chóng)血細(xì)胞的形態(tài)和分類(lèi)學(xué)術(shù)界分歧和困惑很多，這不僅帶來(lái)了血細(xì)胞的分類(lèi)困難，而且還嚴(yán)重影響了對(duì)其生理功能、生化等方面的研究。

2 研究方法

2.1 對(duì)PHA（植物血凝素）的研究

PHA是利用超低溫冷凍技術(shù)從紅蕓豆中提取的一種物質(zhì)，它作為一種有絲分裂原，可以激活免疫細(xì)胞——淋巴細(xì)胞、刺激細(xì)胞增殖，雖較難提純且成本極高，但作為藥劑，PHA已直接用于動(dòng)物及人體，如林義浩[12]以體內(nèi)注射PHA制備魚(yú)類(lèi)腎細(xì)胞染色體，其發(fā)現(xiàn)在近30種魚(yú)類(lèi)注射PHA均具有刺激腎細(xì)胞有絲分裂的作用，而且分裂指數(shù)都很高。

2.2 對(duì)秋水仙素的研究

秋水仙素可以抑制有絲分裂，破壞紡錘體，并將染色體停滯在分裂的中期，它是多倍體誘變的最佳試劑。自美國(guó)學(xué)者A.F.Blakeslee與其團(tuán)隊(duì)于1937年成功使用秋水仙素處理曼陀羅等植物，使其染色體成功加倍以來(lái)，秋水仙素就被廣泛地應(yīng)用于多種科研工作中，如遺傳學(xué)研究、細(xì)胞學(xué)研究、植物育種等。除此之外，秋水仙素還作為臨床藥物作用于動(dòng)物體和人體，有抗炎、抑制腫瘤細(xì)胞等多方面藥理作用。如秋水仙堿通過(guò)干擾溶酶體脫顆粒降低中性粒細(xì)胞的活性、黏附性及趨化性，并可抑制粒細(xì)胞向炎癥區(qū)域遷移，以此發(fā)揮其抗炎作用。此外，秋水仙素可以干擾細(xì)胞間黏附分子及選擇蛋白的表達(dá)，繼而阻礙T淋巴細(xì)胞活化和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而抑制炎癥反應(yīng)。譚秀華[13]等在2007年研究了秋水仙堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞有絲分裂的影響，近期的研究還發(fā)現(xiàn)秋水仙堿能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)，還有誘導(dǎo)凋亡作用，但體內(nèi)的效果尚待臨床研究。

2.3 研究所用染色方法

目前，對(duì)昆蟲(chóng)血細(xì)胞形態(tài)及分類(lèi)的研究較為廣泛，但仍沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的染色方法，雖然Jone在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了歸類(lèi)，但也是基于Giemsa和Wright兩種染色方法。到目前為止對(duì)昆蟲(chóng)血細(xì)胞研究仍然在使用的方法有吉姆薩、賴特、中性紅、蘇木精、甲苯胺藍(lán)等，最廣泛使用的昆蟲(chóng)血細(xì)胞形態(tài)分類(lèi)是吉姆薩染色和賴特染色。本文采用賴特-吉姆薩混合染色法對(duì)中華稻蝗血細(xì)胞進(jìn)行染色。

2.4 研究樣品處理方法

本次研究用蝗蟲(chóng)血細(xì)胞為材料來(lái)研究蝗蟲(chóng)的細(xì)胞分裂相，取中華稻蝗雌性、雄性各20只，在其腹節(jié)注入1%的PHA 15μL，12小時(shí)后加入0.2%秋水仙素2μL，再12小時(shí)后制作血液涂片，用賴特-吉姆薩混合染色15分鐘，沖洗后觀察。另取中華稻蝗雌性、雄性各20只，同法將PHA注入蝗蟲(chóng)體內(nèi)，36小時(shí)后以秋水仙素處理，再12小時(shí)后制作血液涂片，用賴特-吉姆薩混合染色后觀察。

以此類(lèi)推分別于1天、2天、3天、4天后觀察染色處理過(guò)的中華稻蝗血細(xì)胞涂片，從而得出中華稻蝗細(xì)胞分裂相照片。

對(duì)照組取同數(shù)量蟲(chóng)體，注射等量無(wú)菌水代替PHA，其余操作一致。

使用PHA的效價(jià)為10 μg/mL，秋水仙素純度為95%。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

不同分裂時(shí)期中華稻蝗細(xì)胞分裂相照片如圖1、圖2、圖3所示。通過(guò)對(duì)血涂片的觀察，發(fā)現(xiàn)加入PHA以后，可刺激蝗蟲(chóng)血細(xì)胞分裂，血量明顯增加，在加入PHA 1天后就有5%的血細(xì)胞開(kāi)始分裂，許多血細(xì)胞的染色體開(kāi)始凝集；而在加入PHA 2天后仍有5%的分裂細(xì)胞；3天以后明顯減少。PHA處理可得到全部的細(xì)胞分裂各期的分裂相，且所得結(jié)果清晰、容易分辨。

圖1 分裂前期

圖2 分裂中期

圖3 分裂末期

3.2 討論

本研究用蝗蟲(chóng)血細(xì)胞為材料來(lái)研究蝗蟲(chóng)的細(xì)胞分裂相，蝗蟲(chóng)的血細(xì)胞雖然不是周期細(xì)胞，但可以通過(guò)PHA刺激血細(xì)胞分裂從而得到周期細(xì)胞，進(jìn)而可以觀察到蝗蟲(chóng)血細(xì)胞的分裂過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)用PHA處理蝗蟲(chóng)細(xì)胞尚屬首次，此法擺脫了采集被試材料性別、部位的限制，比前人所用方法簡(jiǎn)單實(shí)用、結(jié)果穩(wěn)定性佳。從觀察結(jié)果來(lái)看，蝗蟲(chóng)注入PHA在4天后只有1%的分裂細(xì)胞，說(shuō)明在處理之后的一段時(shí)間細(xì)胞分裂已基本恢復(fù)，因此在實(shí)驗(yàn)時(shí)不需要?dú)⑺阑认x(chóng)，可以達(dá)到反復(fù)使用、可持續(xù)發(fā)展。