邵亦心 王朵勤 沈燕蕓 朱奕锜 徐金華 唐慧

200040上海，復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科

肥大細胞作為固有免疫細胞之一，廣泛分布于皮膚、呼吸道、消化道黏膜等外界屏障組織，通過IgE依賴及非IgE依賴性途徑釋放各種致敏介質、細胞因子，參與免疫調節(jié)和炎癥反應，在過敏性、感染性、炎癥性及免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［1］。目前常用的肥大細胞株，包括人肥大細胞系HMC?1、LAD2，大鼠嗜堿性粒細胞來源的RBL2H3，小鼠肥大細胞系P815等，都不同程度地缺乏成熟肥大細胞的功能與特性，如HMC?1細胞IgE高親和力受體（FcεRⅠ）表達水平低，LAD2細胞培養(yǎng)成本高、周期長，一些細胞因子表達水平較低等［2］。因此原代培養(yǎng)高純度的哺乳動物肥大細胞將成為研究肥大細胞生物學特性及功能的有效手段。本研究旨在通過簡單方法分別對小鼠腹腔及骨髓細胞進行白細胞介素3（IL?3）和干細胞因子（SCF）聯(lián)合誘導培養(yǎng)，以獲得大量高純度肥大細胞，并鑒定其脫顆粒功能，為相關疾病免疫機制及治療后續(xù)研究奠定細胞學基礎。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：雌性C57BL/6小鼠12只，6～8周齡，SPF級，體重18～22 g，健康狀態(tài)良好，來自上海靈暢生物科技有限公司，許可證號SCXK（滬）2013?0018，合格證號2013001816972。

2.主要試劑：小鼠重組IL?3和SCF來自美國Peprotech公司，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清來自美國Gibco公司，藻紅蛋白（PE）?CD117、異硫氰酸熒光素（FITC）-FcεRⅠα來自美國eBioscience公司，4-硝基苯-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷來自美國Sigma公司。

二、方法

1.小鼠腹腔源性肥大細胞（peritoneal?derived mastcells，PMC）分離培養(yǎng)：脫頸椎處死小鼠后，無菌環(huán)境下對小鼠腹腔穿刺，注入5Ml無菌PBS，按摩腹部1min，沿腹中線剪開皮膚，暴露腹膜，小心抽出腹腔灌洗液（如出現(xiàn)血管破裂需裂解紅細胞），離心棄上清液，調整細胞密度至5×105/ml加入到培養(yǎng)體系中（含RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素100 U/Ml、鏈霉素100mg/L、小鼠重組IL?3和SCF各20μg/L），接種于培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每7天收集懸浮細胞轉移至新培養(yǎng)板中培養(yǎng)，在培養(yǎng)第2周時收集部分細胞，對其進行形態(tài)及功能鑒定，其他細胞繼續(xù)培養(yǎng)直至開始凋亡。

2.小鼠骨髓源性肥大細胞（bone marrow?derivedmast cells，BMMC）分離培養(yǎng)：脫頸椎處死小鼠后，無菌環(huán)境下分離小鼠雙側股骨，盡量剔除肌肉組織，剪斷兩端骨骺，用1Ml注射器吸取RPMI1640培養(yǎng)基，反復沖洗骨髓腔收集細胞懸液，100μm細胞濾網(wǎng)過濾后離心，棄上清液，調整細胞密度至1×106/Ml加入到培養(yǎng)體系中（含RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素100 U/Ml、鏈霉素100mg/L、小鼠重組IL?3和SCF各10μg/L），接種于培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每7天收集懸浮細胞轉移至新的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，在培養(yǎng)第4周時收集部分細胞，對其進行形態(tài)及功能鑒定，其他細胞繼續(xù)培養(yǎng)直至開始凋亡。

3.肥大細胞鑒定：

（1）甲苯胺藍染色：將培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC滴到多聚賴氨酸包被的載玻片上，風干，加入1%pH7.4的甲苯胺藍染液靜置約30 s，用95%乙醇分色，三蒸水洗滌，光鏡下觀察。

（2）流式細胞儀檢測：分別收集培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC，PBS洗2次，調整細胞密度至1× 106/ml，每管取100μl，單染管分別加入0.5μl PE?CD117及0.2 μl FITC?FcεRⅠα，雙染管同時加入兩種抗體，空白管不加抗體，4℃避光孵育30min，PBS洗2次，上機檢測。

4.脫顆粒功能檢測：

（1）肥大細胞脫顆粒率測定：將培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC以5×105/ml鋪于12孔板（1ml/孔），分別加入0（空白對照）、1、10、100、1 000 mg/L的Compound48/80刺激1 h，收集細胞懸液進行甲苯胺藍染色，每張玻片鏡下計數(shù)1 000個肥大細胞。肥大細胞脫顆粒率=脫顆粒肥大細胞數(shù)/肥大細胞總數(shù)×100%

（2）肥大細胞β己糖胺酶釋放率測定：將培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC以5×105/Ml鋪于12孔板（1 ml/孔），分別加入0（空白對照）、10、100mg/LCompound48/80刺激1 h，離心，分別收集細胞沉淀及上清液。將上清液轉入96孔板，80μl/孔，每孔加入80μl反應緩沖液（含40mmol/L檸檬酸，2mmol/L 4-硝基苯-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖，pH4.5）37℃孵育 1.5 h，加入 60μl終止反應液（0.4mol/L甘氨酸，pH10.7），立即于405 nm處測量吸光度（A值）。用1Ml裂解液（含0.5%Triton X?100）冰浴裂解細胞沉淀10min，離心取上清液，其余步驟和上清液處理方式相同。β己糖胺酶釋放率=上清液A405值/（上清液A405值+胞內(nèi)A405值）×100%。

5.統(tǒng)計學分析：用GraphPad軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、細胞形態(tài)學觀察

PMC培養(yǎng)24 h及BMMC培養(yǎng)48 h時出現(xiàn)貼壁細胞，呈梭形及類圓形，可見大小不等懸浮細胞。隨培養(yǎng)時間延長，懸浮細胞逐漸增多，貼壁細胞逐漸減少。PMC培養(yǎng)2周及BMMC培養(yǎng)4周時貼壁細胞基本消失，懸浮細胞形態(tài)、大小、分布趨于一致且折光性良好，表現(xiàn)為大小相近、向中央聚集的類圓形細胞，高倍鏡下可見胞膜上絲狀突起，偶可見處于自發(fā)脫顆粒狀態(tài)的不規(guī)則細胞。一般于培養(yǎng)10周后細胞開始凋亡。見圖1。

圖1 光鏡下不同誘導時期肥大細胞形態(tài)（×400） 1A：小鼠骨髓源性肥大細胞（BMMC）培養(yǎng)第7天，細胞大小形態(tài)不一，存在較多貼壁細胞；1B：BMMC培養(yǎng)第4周，貼壁細胞消失，可見大小形態(tài)相近的類圓形懸浮細胞；1C：小鼠腹腔源性肥大細胞（PMC）培養(yǎng)第3天，可見類圓形懸浮細胞及梭形貼壁細胞；1D：PMC培養(yǎng)第2周，貼壁細胞消失，懸浮細胞大小形態(tài)趨于一致

二、肥大細胞成熟度

對培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC行甲苯胺藍染色，可見細胞核呈藍色，胞質內(nèi)含紫紅色異染顆粒的細胞數(shù)達95%以上，證實所獲得的細胞為成熟肥大細胞（圖2）。

圖2 肥大細胞甲苯胺藍染色（×400）

三、肥大細胞表面CD117及FcεRⅠα分子表達

培養(yǎng)2周的PMC（n=8）及培養(yǎng)4周的BMMC（n=12）CD117單陽性率分別為97.00%±1.21%及98.43%±0.22%，F(xiàn)cεRⅠα單陽性率分別為98.56%±0.47%及95.86%±0.70%，雙陽性率分別為97.68%±0.80%及96.12%±0.76%，兩種細胞雙陽性率差異無統(tǒng)計學意義（t=1.366，P ＞0.05）。見圖3。

四、肥大細胞脫顆粒率

Compound48/80刺激1 h后，培養(yǎng)2周PMC及培養(yǎng)4周BMMC的脫顆粒率在各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=36.382、29.887，均P＜0.001）。1、10、100、1 000μg/mlCompound48/80均可增加培養(yǎng)4周BMMC及培養(yǎng)2周PMC脫顆粒率，其中100mg/L和1000mg/L劑量組與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

五、肥大細胞β己糖胺酶釋放率

Compound48/80作用1 h后，培養(yǎng)2周PMC及培養(yǎng)4周BMMC的β己糖胺酶釋放率在各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=40.013、66.991，均P＜0.001）。10mg/L和100mg/LCompound48/80均可增加兩種細胞β己糖胺酶釋放率，與空白對照組比較，100mg/L劑量組BMMC（P ＜ 0.000 1）以及10mg/L、100mg/L劑量組PMC（P ＜0.05、0.000 1）β己糖胺酶釋放率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（表2）。

討 論

肥大細胞起源于骨髓造血干細胞，遷移至組織定植前為未成熟狀態(tài)，組織環(huán)境是其分化成熟的必要條件。根據(jù)定居組織位置不同，肥大細胞分為結締組織型肥大細胞和黏膜型肥大細胞。不同類型肥大細胞的生物學特性及功能不盡相同［3?4］。肥大細胞是蕁麻疹、血管性水腫等皮膚病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，在肥大細胞增生癥、特應性皮炎、銀屑病、類天皰瘡、皮膚念珠菌病等多種皮膚病中也發(fā)揮重要作用。由于人原代肥大細胞培養(yǎng)仍是難題，獲得不同類型鼠源肥大細胞將有助于深入研究肥大細胞在這些皮膚病中的發(fā)病機制，并對其治療提供新的選擇。本文介紹了小鼠骨髓與腹腔來源肥大細胞的原代培養(yǎng)方法。該方法克服了密度梯度離心法、磁珠分離法、流式分選法等傳統(tǒng)方法獲得的細胞數(shù)量少、純度低、成本高的缺陷［5］，分別由未成熟肥大細胞前體和結締組織型肥大細胞誘導分化增殖，在較短時間內(nèi)可獲得大量兩種不同類型高純度成熟肥大細胞。肥大細胞在培養(yǎng)時呈懸浮生長，我們在原代培養(yǎng)過程中通過不斷傳代，逐漸剔除貼壁細胞，由于PMC及BMMC分別在培養(yǎng)2周及4周時，貼壁細胞基本消失，故選擇該時間節(jié)點收集懸浮細胞進行后續(xù)鑒定。

圖3 流式細胞儀檢測肥大細胞表面CD117及FcεRⅠα分子表達 3A～3D：培養(yǎng)4周小鼠骨髓源性肥大細胞；3E～3H：培養(yǎng)2周腹腔源性肥大細胞

表1 不同濃度Compound48/80刺激對PMMC及PMC脫顆粒率的影響（%±s）

表1 不同濃度Compound48/80刺激對PMMC及PMC脫顆粒率的影響（%±s）

注：n=6。與空白對照組比較，a P＜0.01，b P＜0.001，c P＜0.000 1。BMMC：小鼠骨髓源性肥大細胞，PMC：小鼠腹腔源性肥大細胞

Compound48/80濃度0（空白對照組）1mg/L 10mg/L 100mg/L 1 000mg/L F值P值4周BMMC 14.33±8.25 21.33±9.26 36.67±6.12 84.00±5.57a 93.67±0.88b 29.887＜0.001 2周PMC 12.60±4.71 24.40±5.99 31.40±7.74 74.00±5.30c 89.20±2.60c 36.382＜0.001

表2 不同濃度Compound48/80刺激對PMMC及PMC β己糖胺酶釋放率的影響（%±s）

注：n=6。與空白對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.000 1。BMMC：小鼠骨髓源性肥大細胞，PMC：小鼠腹腔源性肥大細胞

Compound48/80濃度0（空白對照組）10mg/L 100mg/L F值P值4周BMMC 15.56±2.79 19.42±3.93 64.32±3.11b 66.991＜0.001 2周PMC 13.89±2.70 30.96±5.01a 59.54±2.73b 40.013＜0.001

IL?3又稱多集落刺激因子或肥大細胞生長因子，被認為是調節(jié)肥大細胞生長、分化、遷移和效應的重要細胞因子。它主要由活化T細胞、天然殺傷（NK）細胞和肥大細胞產(chǎn)生，并且支持SCF對肥大細胞前體的生長、分化、擴增的促進作用［6?7］。CD117（c?kit）是SCF的配體，除存在于肥大細胞表面外，還廣泛表達于各種造血祖細胞、淋巴祖細胞、黑素細胞、某些干細胞等。成熟肥大細胞表達大量高親和力IgE受體FcεRⅠα，驅動IgE介導速發(fā)型變態(tài)反應。但FcεRⅠα還表達于嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、朗格漢斯細胞等表面，只有肥大細胞同時表達CD117和FcεRⅠα［8］。成熟肥大細胞胞質內(nèi)充滿強嗜堿性顆粒，顆粒內(nèi)含有組胺、5羥色胺、肝素等介質。甲苯胺藍可使組胺、肝素等物質呈異染性紫紅色，細胞核呈藍色，因此常用于肥大細胞的識別和鑒定［9］。故本研究通過甲苯胺藍染色及細胞表面CD117和FcεRⅠα的表達鑒定來評估肥大細胞純度和成熟度，結果顯示IL?3和SCF誘導培養(yǎng)2周及4周后小鼠腹腔及骨髓來源肥大細胞甲苯胺藍染色陽性率及共表達CD117和FcεRⅠα的比例均達到95%以上，且PMC和BMMC同時表達CD117和FcεRⅠα的雙陽性率差異無統(tǒng)計學意義。

肥大細胞脫顆粒是肥大細胞區(qū)別于其他細胞的一種特異性功能狀態(tài)，在速發(fā)型變態(tài)反應中是肥大細胞活化的重要標志，因此有必要對誘導培養(yǎng)獲得的小鼠骨髓及腹腔來源肥大細胞進行脫顆粒功能評估。Compound48/80是一種常用促肥大細胞脫顆粒人工合成化合物［10］。組胺、類胰蛋白酶、β己糖胺酶常被用作定量測定肥大細胞脫顆粒水平的生物標志物。組胺由于相對分子質量小、無免疫原性、生理狀態(tài)下半衰期短，較類胰蛋白酶及β己糖胺酶檢測結果重復性差［11?12］。本研究利用鏡下計數(shù)肥大細胞脫顆粒率及定量測定β己糖胺酶釋放率兩種方法，檢測不同濃度Compound48/80刺激后小鼠骨髓及腹腔來源肥大細胞的脫顆粒水平，結果顯示，Compound48/80可促進培養(yǎng)2周PMC及培養(yǎng)4周BMMC脫顆粒。與培養(yǎng)4周BMMC相比，較低濃度Compound48/80即可使培養(yǎng)2周的PMCβ己糖胺酶釋放率顯著提高，提示培養(yǎng)2周PMC較培養(yǎng)4周BMMC對Compound48/80更敏感。這一結論需要進一步測定肥大細胞脫顆粒的其他代表性生物標志物加以驗證。

綜上，本研究通過形態(tài)學及功能學兩方面鑒定誘導培養(yǎng)的小鼠腹腔及骨髓來源肥大細胞，證實獲得細胞具有成熟肥大細胞的生物學特性及功能，使后續(xù)基礎及臨床研究成為可能。