基于管壁磁共振成像初步探討頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性的關(guān)系

崔 豹，孫興旺，祝玉芬，杜昱平，崔進(jìn)國， 馬 露，蔡劍鳴

1白求恩國際和平醫(yī)院放射診斷科，石家莊 0500822中國人民解放軍總醫(yī)院放射診斷科，北京 100853

腦卒中死亡率、致殘率、復(fù)發(fā)率高，是危害我國居民健康的重大慢性病[1]，高血壓是首要危險(xiǎn)因素，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊發(fā)生率高，易引起缺血性腦卒中[2]。AS具有多血管床性，頸動(dòng)脈位置表淺易于影像學(xué)檢測，可以作為在體監(jiān)測全身疾病進(jìn)程的良好“窗口”。頸動(dòng)脈管壁磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)能夠清晰顯示頸動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)及斑塊內(nèi)容物，可以“一站式”多方面評(píng)價(jià)斑塊穩(wěn)定性及管壁形態(tài)，具有很高的敏感性和可重復(fù)性[3- 4]。頸動(dòng)脈血管壁內(nèi)含有腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotension system，RAS)各種組成成分，并在原發(fā)性高血壓AS進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[5- 6]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)作為RAS重要組成部分，從分子生物學(xué)和影像學(xué)多個(gè)層面研究ACE對(duì)頸動(dòng)脈AS的影響，有利于早期個(gè)體化藥物治療，有效干預(yù)高血壓AS斑塊及缺血性腦卒中。研究發(fā)現(xiàn)ACE插入或缺失(insertion or deletion，I/D)基因多態(tài)性中等位基因D是頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重要危險(xiǎn)因素，尤其在腦卒中患者中[7- 12]。為有效加大腦卒中高危人群篩查和干預(yù)力度，本研究應(yīng)用管壁MRI技術(shù)，初步探討高血壓患者頸動(dòng)脈AS斑塊內(nèi)容物、管壁形態(tài)和臨床癥狀與ACE I/D基因多態(tài)性的相關(guān)性。

對(duì)象和方法

對(duì)象及分組前瞻性收集2012年3月至2014年9月中國人民解放軍總醫(yī)院進(jìn)行頸動(dòng)脈管壁磁共振成像的原發(fā)性高血壓患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：平均收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒張壓≥90 mmHg和/或服用降壓藥物[13]；明確患者ACE I/D基因型；MRI檢查至少一側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈斑塊最大厚度≥1.5 mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往顱內(nèi)出血、腫瘤、感染、心源性腦卒中、頸動(dòng)脈閉塞、頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)；MRI無法評(píng)估斑塊內(nèi)容物及管壁形態(tài)學(xué)指標(biāo)；完全鈣化斑塊。以單側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈斑塊為獨(dú)立樣本，共納入75例患者。男性65例、女性10例，年齡45～87歲，平均(67.00±11.11)歲。斑塊最大厚度為(3.69±1.28)mm。根據(jù)ACE I/D基因多態(tài)性及等位基因“D”的AS易感性[8- 12]，將研究對(duì)象分為ACE Ⅱ基因型患者37例、ACE ID/DD基因型患者38例。搜集患者臨床資料，包括高血壓病程及控制情況，有無規(guī)律服用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)或血管緊張素受體阻滯劑(angiotensin receptor blocker，ARB)降壓藥物，有無缺血性腦卒中癥狀，是否服用調(diào)脂藥物，有無心腦血管病主要危險(xiǎn)因素(冠心病、吸煙史、血脂異常、糖尿病及家族史)等。

ACEI/D基因多態(tài)性分析收集患者外周血2 ml，使用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取試劑盒提取血液凝塊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為5’-CTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCT- 3’，下游引物為5’-GACGTGGCCATCACATTCGTCAGAT- 3’。取5 μl PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于含0.5 μg/ml的溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增，凝膠成像儀下觀察并保存擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種片段：490和190 bp，兩種片段均有者為插入/缺失雜合型(ID)；只有490 bp片段者為純合插入型(Ⅱ)，有插入序列；只有190 bp片段者為純合缺失型(DD)，無插入序列[2，9，11]。

頸動(dòng)脈管壁MRI檢查采用3.0 T Signa HDx磁共振掃描儀及華盛頓大學(xué)頸動(dòng)脈4通道相控陣表面線圈。主要序列參數(shù)：(1)三維時(shí)間飛躍法“亮血”圖像：重復(fù)時(shí)間29.00 ms，回波時(shí)間 2.10 ms，反轉(zhuǎn)角20°，掃描后重建橫軸位圖像，層數(shù)24。(2)T1加權(quán)圖像：四反轉(zhuǎn)恢復(fù)快速自旋回波“黑血”序列，重復(fù)時(shí)間800.00 ms，間隔時(shí)間600.00 ms，回波時(shí)間 7.30 ms，反轉(zhuǎn)角90°，層數(shù)12。(3)T2加權(quán)圖像：重復(fù)時(shí)間3000.00 ms，回波時(shí)間 60.00 ms，反轉(zhuǎn)角90°，層數(shù)19。(4)對(duì)比增強(qiáng)T1加權(quán)圖像：靜脈注入磁共振釓造影劑(釓噴酸葡胺，劑量0.2 mmol/kg，流率2 ml/s)5 min后行四反轉(zhuǎn)恢復(fù)T1加權(quán)序列。各序列均以雙側(cè)分叉角中間高度為中心，視野140 mm×140 mm，矩陣256×256，層厚2 mm，層間隔0。三維時(shí)間飛躍法或T2加權(quán)圖像掃描范圍較大，需要顯示斑塊層面及頸內(nèi)動(dòng)脈膨大處遠(yuǎn)端走行正常且無AS管壁層面。

頸動(dòng)脈管壁MRI圖像分析雙盲測評(píng)價(jià)影像學(xué)資料。

斑塊內(nèi)容物評(píng)價(jià)：斑塊內(nèi)出血表現(xiàn)為三維時(shí)間飛躍法和T1加權(quán)圖像均呈高信號(hào)。纖維帽薄或破裂表現(xiàn)為三維時(shí)間飛躍法斑塊表面完整帶狀低信號(hào)缺失或者可見高信號(hào)“龕影”，對(duì)比增強(qiáng)T1加權(quán)圖像纖維帽變薄或局部缺損，邊緣可見強(qiáng)化[14- 15]。

管壁形態(tài)測量：多對(duì)比度圖像相互參照，在顯示管壁邊界最清晰的圖像上測量。多次測量斑塊各層面最大厚度，在斑塊最厚層面測量斑塊最大厚度、管壁最大面積和斑塊處血管橫截面積(cross-sectional vessel area，CSVA)。管壁最大面積=斑塊處CSVA-管腔面積。標(biāo)準(zhǔn)化管壁指數(shù)=管壁最大面積/斑塊處CSVA。在斑塊遠(yuǎn)端層面即頸內(nèi)動(dòng)脈膨大遠(yuǎn)端走行正常相對(duì)無AS管壁層面測量CSVA。頸動(dòng)脈重構(gòu)指數(shù)(carotid remodeling index，CRI)定義為斑塊最厚層面CSVA與遠(yuǎn)端頸內(nèi)動(dòng)脈層面CSVA之比。

結(jié) 果

一般資料ACE Ⅱ基因型患者37例，ACE ID/DD基因型患者38例(ACE ID基因型26例、ACE DD基因型12例)。與ACE Ⅱ基因型相比，ACE ID/DD基因型患者易發(fā)生缺血性腦卒中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.921，P=0.048)(表1)。2組血脂異常比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.146，P=0.042)(表1)。2組患者在年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、高血壓病程、平均收縮壓、平均舒張壓、冠心病、糖尿病、心腦血管病家族史等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。

影像資料ACE Ⅱ基因型與ACE ID/DD基因型患者頸內(nèi)動(dòng)脈斑塊內(nèi)出血、纖維帽薄或破裂的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.037，P=0.300；χ2=1.779，P=0.075)(表2)。2組斑塊層面和遠(yuǎn)端層面管壁形態(tài)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表2)。38例ACE ID/DD基因型高血壓患者中，21例服用ACEI/ARB者比17例未服用者的CRI小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.85±0.60 比 2.48±0.40；t=3.854，P=0.001)(圖1A)；頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)端CSVA有增大的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(40.87±20.45)mm2比(29.86±13.85)mm2；t=1.893，P=0.066](圖1B)；斑塊最大厚度及標(biāo)準(zhǔn)化管壁指數(shù)有減少的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1C、1D)。在ACE Ⅱ基因型高血壓患者中，上述管壁形態(tài)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

多因素回歸分析結(jié)果以CRI為因變量，年齡、ACE I/D基因型、穩(wěn)定性高血壓、高血壓病程、服用ACEI/ARB、斑塊最大厚度為自變量進(jìn)行多因素線性回歸分析，調(diào)整決定系數(shù)為0.165，估計(jì)值的標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.584，P=0.013，結(jié)果顯示，服用ACEI/ARB的高血壓患者CRI有減小趨勢(回歸系數(shù)=-0.408，t=-2.816，P=0.007)。高血壓患者頸動(dòng)脈斑塊最大厚度增大，CRI有增大趨勢(回歸系數(shù)=0.143，t=2.544，P=0.013)。

表 1 ACE Ⅱ基因型與ACE ID/DD基因型一般資料比較Table 1 Comparison of the clinical findings between ACE Ⅱ genotype group and ACE ID/DD genotype group

1 mmHg=0.133 kPa；ACE：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶；Ⅱ：純合插入型；ID：插入/缺失雜合型；DD：純合缺失型；IQR：四分位距；ACEI：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑；ARB：血管緊張素受體拮抗劑

ACE：angiotensin-converting enzyme；Ⅱ：homozygous insertion；ID：heterozygous insertion/deletion；DD：homozygous deletion；IQR：interquartile range；ACEI：angiotensin-converting enzyme inhibitor；ARB：angiotensin receptor blocker

表 2 ACE Ⅱ基因型與ACE ID/DD基因型ICA斑塊內(nèi)容物及管壁形態(tài)比較Table 2 Comparison of ICA plaque composition and vessel wall morphology between ACE Ⅱ genotype group and ACE ID/DD genotype group

CSVA：血管橫截面積；ICA：頸內(nèi)動(dòng)脈

CSVA：cross-sectional vessel area；ICA：internal carotid artery

討 論

本研究初步探討ACE I/D基因多態(tài)性對(duì)高血壓患者頸動(dòng)脈斑塊的影響，結(jié)果顯示ACE ID/DD基因型患者可能與缺血性腦卒中存在關(guān)聯(lián)，ACE Ⅱ基因型與ACE ID/DD基因型斑塊穩(wěn)定狀態(tài)及管壁形態(tài)無差異。不同基因型高血壓患者服用ACEI/ARB，頸動(dòng)脈管壁形態(tài)變化可能不同。ACE ID/DD基因型患者中，服用ACEI/ARB者比未服用者CRI較小，頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)端CSVA較大。

等位基因D是頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重要危險(xiǎn)因素，尤其在腦卒中患者中[8- 12]，本研究顯示ACE ID/DD基因型患者易發(fā)生缺血性腦卒中。大樣本及相關(guān)病理研究顯示，ACE DD基因型頸動(dòng)脈斑塊易損性較ID和Ⅱ基因型更為明顯[8- 12]，但本研究基于頸動(dòng)脈管壁MRI在體研究，尚未發(fā)現(xiàn)ACE Ⅱ基因型與ACE ID/DD基因型之間斑塊易損性及管壁形態(tài)存在差異，這或許與樣本量小有關(guān)。Kalita等[7]研究152例既往發(fā)生缺血性腦卒中的高血壓患者，發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)外血管磁共振成像異常與ACE DD基因型具有顯著相關(guān)性(OR=3.9)，但在顱內(nèi)外血管磁共振成像未見異常的缺血性腦卒中患者中未見此相關(guān)性。頸動(dòng)脈管壁MRI對(duì)于判斷頸動(dòng)脈斑塊形態(tài)及易損性具有很高的敏感性和可重復(fù)性，可追隨觀察頸動(dòng)脈血管重構(gòu)及斑塊進(jìn)展情況，大樣本研究分析其與ACE I/D基因多態(tài)性關(guān)系，有助于從基因水平了解ACE對(duì)頸動(dòng)脈斑塊的影響。

RAS參與高血壓的發(fā)生與維持，ACE與動(dòng)脈粥樣硬化及血管重構(gòu)相關(guān)。有研究顯示RAS與炎癥關(guān)系密切，頸動(dòng)脈血管壁也有RAS各種組成成分，并在原發(fā)性高血壓AS進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[5- 6]。血管緊張素Ⅰ經(jīng)ACE轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅱ，在生理?xiàng)l件下維持血管壁結(jié)構(gòu)和張力。在高血壓及AS進(jìn)程中，血管緊張素Ⅱ在調(diào)節(jié)血管壁功能與結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)血管壁發(fā)生AS時(shí)，局部血管緊張素Ⅱ增加導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞肥大，參與血管重構(gòu)，同時(shí)作為一種促炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)多種炎性因子表達(dá)，促進(jìn)斑塊進(jìn)展。血管緊張素Ⅱ還可以促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的生成，分解細(xì)胞外基質(zhì)，削弱纖維帽厚度并最終增加AS斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)[2，12]。

○：離散值；*：極端值

○：discrete value；*：extreme value

A.ICA頸動(dòng)脈重構(gòu)指數(shù)；B.遠(yuǎn)端ICA CSVA；C. ICA標(biāo)準(zhǔn)化管壁指數(shù)；D. ICA斑塊最大厚度

A. ICA carotid remodeling index；B. distal ICA CSVA；C. ICA normalized wall index；D. ICA maximum plaque thickness

圖1服用ACEI/ARB降壓藥物對(duì)ACE Ⅱ 基因型和ACE ID/DD基因型患者ICA管壁形態(tài)的影響

Fig1Effect of antihypertensive drug ACEI/ARB on ICA vessel wall morphology in ACE Ⅱ genotype group and ACE ID/DD genotype group

在自身易感因素及服用不同降壓藥物等因素影響下，不同高血壓AS斑塊的轉(zhuǎn)歸以及與臨床癥狀的關(guān)系可能不同。本研究顯示ACE ID/DD基因型患者可能與缺血性腦卒中存在關(guān)聯(lián)，然而，服用ACEI/ARB降壓藥物可增大ACE ID/DD基因型患者斑塊遠(yuǎn)端CSVA，進(jìn)而改善血管順應(yīng)性，減小CRI?；A(chǔ)研究證明，與其他類降壓藥物不同，ACEI/ARB能夠發(fā)揮強(qiáng)有力的抗AS作用[16]，不僅因?yàn)榻档脱獕?，而且因?yàn)槠渚哂锌寡?、抗增殖及抗氧化特性，具有改善血管順?yīng)性、減弱斑塊易損性的作用，從而減少缺血性心腦血管事件發(fā)生率[16]。

頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和原位雜交法可以檢測斑塊中ACE蛋白和mRNA的表達(dá)水平，分析其與斑塊內(nèi)各種細(xì)胞之間的相互關(guān)系。體外研究顯示，在有明確脂質(zhì)壞死核的斑塊中，ACE蛋白和mRNA主要來源于斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞，以及斑塊內(nèi)新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞，說明斑塊內(nèi)ACE與斑塊炎性活動(dòng)密切相關(guān)，進(jìn)而推測斑塊內(nèi)ACE活性與斑塊的進(jìn)展相關(guān)[17]。近年國內(nèi)外MRI及病理研究闡述了頸動(dòng)脈血管重構(gòu)指數(shù)CRI與斑塊易損性及缺血性腦卒中的相關(guān)性[18- 19]，本研究顯示，服用ACEI/ARB可明顯減小ACE ID/DD基因型患者CRI，進(jìn)而改善管壁順應(yīng)性。另外，在分子影像學(xué)方面，磁共振新型對(duì)比劑P947或許可以在體定量測量斑塊內(nèi)ACE活性[20]，為鑒別頸動(dòng)脈斑塊易損性提供幫助，并有望在體追蹤觀察ACEI等藥物穩(wěn)定頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊療效。

本研究應(yīng)用管壁MRI技術(shù)，探討高血壓患者頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定狀態(tài)、管壁形態(tài)與ACE I/D基因多態(tài)性關(guān)系，國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道少見。本研究屬于初步探索性研究。因此，在未來工作中，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并設(shè)計(jì)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)方案，有助于減小研究偏倚，有助于深入探討ACE ID/DD基因型與頸動(dòng)脈重構(gòu)關(guān)系以及ACEI/ARB降壓藥的相關(guān)影響。三維“黑血”管壁成像技術(shù)[21]成像速度快、掃描范圍大，有利于顯示復(fù)雜管壁形態(tài)，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

綜上，在原發(fā)性高血壓患者中，ACE ID/DD基因型與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊之間可能存在關(guān)聯(lián)性。