關(guān)雅南，張 浩，李曉雙，連麗麗，王希越，高文秀，祝 波，婁大偉

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

汞是一種高毒性的重金屬離子，在江河湖泊、工廠污水等環(huán)境中廣泛存在.汞及其化合物是劇毒性的環(huán)境污染物[1]，可對人類的身體健康構(gòu)成不同程度的危害.因此，研究我們?nèi)祟惖娘嬘盟蠬g2+離子的定性分析具有重要意義[2,3].目前，檢測Hg2+離子的方法有很多，包括原子吸收光譜法[4]、電化學(xué)分析法[5,6]、比色法[7]、熒光法[8,9]等，其中，熒光法由于具有操作簡單，分析檢測時間短，成本低，選擇性好等眾多優(yōu)點(diǎn)，受到了人們的廣泛關(guān)注.因此，我們選擇使用熒光法對Hg2+離子進(jìn)行檢測.近年來，隨著石墨烯的強(qiáng)大發(fā)展與應(yīng)用，二維類石墨烯物質(zhì)也引起了人們的研究興趣.目前，二維類石墨烯物質(zhì)(包括過渡金屬二硫化物，氧化物等)由于具有其獨(dú)特的二維層狀結(jié)構(gòu)，在檢測方面有很多應(yīng)用.并且國內(nèi)外研究者在檢測應(yīng)用方面也做出了很多報道.如Hao,Liling等人[10]報道了一種改進(jìn)的基于RCA的CRET適體傳感器，用于通過化學(xué)發(fā)光供體Co2+/ABEI-AuNFs和化學(xué)發(fā)光受體層狀WS2納米片之間的CRET過程來檢測金黃色葡萄球菌.WS2是典型的層狀結(jié)構(gòu)材料，具有片層的堆疊，在層與層之間有較弱的范德華力，能夠通過物理或化學(xué)方法得到少層或單層的片狀結(jié)構(gòu)[11].在本文中，我們提出了一種DNA與WS2相互作用檢測Hg2+離子的新方法.通過研究WS2的濃度對實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的影響，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件，從而對一系列的Hg2+離子濃度進(jìn)行檢測.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

DNA寡核苷酸是從上海生工生物工程技術(shù)有限公司購買的.DNA寡核苷酸序列為：3′-FAM-TTTCTTCTTGGGTTGTTGTTT-5′.

NaCl，MgCl2和Hg(NO3)2購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)均購自中國天津市永大化學(xué)試劑有限公司.自制40 mmol·L-1pH 7.4的PBS緩沖液(將7.16 g Na2HPO4·12H2O和3.12 g NaH2PO4·2H2O在1 L超純水中溶解)，在整個實(shí)驗(yàn)中使用.

熒光測量使用的是島津RF-5301PC光譜熒光光度計.在520 nm激發(fā)波長處得到熒光光譜.pH值測量使用的是中國北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)的Sartorius PB-10 pH計.超純水是使用Milli-Q試劑水系統(tǒng)(Millipore，Bedford，MA，USA)純化的.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

將25 μmol·L-13 μL ssDNA、40 mmol·L-1150 μL PBS緩沖溶液、3 mol·L-110 μL NaCl和3 mol·L-110 μL MgCl2混合在一起，然后，將不同濃度的10 μL WS2加入到上述混合溶液中，在25 ℃下振蕩反應(yīng)30 min.最后，將一系列不同濃度的10 μL Hg2+離子加入到該混合溶液體系中，在25 ℃下振蕩反應(yīng)30 min，混合溶液的總體積為300 μL.所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次.

2 結(jié)果與討論

2.1 該方法檢測Hg2+離子可行性分析

為了驗(yàn)證該方法的可行性，我們分別對以下三種情況進(jìn)行了測定：(a)不加WS2和待測物Hg2+離子；(b)加WS2，不加待測物Hg2+離子；(c)加WS2和待測物Hg2+離子.如圖1所示，發(fā)現(xiàn)不加WS2和待測物Hg2+離子的a曲線的熒光強(qiáng)度最高；加WS2，不加待測物Hg2+離子的b曲線的熒光強(qiáng)度最低；加WS2和待測物Hg2+離子的c曲線的熒光強(qiáng)度與b曲線相比又增強(qiáng).

Wavelength/nm圖1 不同條件下測得的熒光光譜圖

這是由于DNA與WS2相互作用，當(dāng)不存在待測物Hg2+離子時，被標(biāo)記在ssDNA上的羧基熒光素(FAM)基團(tuán)吸附在WS2上，由于發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光淬滅；當(dāng)待測物Hg2+離子存在時，ssDNA中的胸腺嘧啶(T)與Hg2+離子形成T-Hg2+-T錯配結(jié)構(gòu)，其余部分根據(jù)堿基配對原則，雜交形成剛性的雙鏈DNA(dsDNA)，標(biāo)記的FAM熒光基團(tuán)不會吸附在WS2上，因此，體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng).實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明此方法檢測Hg2+離子可行.

2.2 WS2的濃度對反應(yīng)的影響

由于WS2在整個實(shí)驗(yàn)中起到了很重要的作用，并且WS2的濃度對實(shí)驗(yàn)反應(yīng)也有一定的影響，因此，對WS2的一系列濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn).如圖2所示，其中，從a到f的WS2濃度分別為0 mg/ml；0.003 mg/ml；0.01 mg/ml；0.017 mg/ml；0.023 mg/ml；0.03 mg/ml.從圖中可以看出，隨著WS2的濃度增大，實(shí)驗(yàn)體系的熒光強(qiáng)度逐漸下降.為了滿足實(shí)驗(yàn)的檢測條件，將濃度為0.017 mg/ml的WS2，選擇用于進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn).

Wavelength/nm圖2 WS2的濃度對反應(yīng)的影響圖

2.3 Hg2+離子檢測

基于確定了WS2的最佳濃度，因此，對一系列的Hg2+離子濃度進(jìn)行了檢測.如圖3所示，其中，從a到e的Hg2+離子濃度分別為0 nmol·L-1；80 nmol·L-1；320 nmol·L-1；800 nmol·L-1；1 600 nmol·L-1.從圖中可以明顯看出，隨著加入的Hg2+離子濃度越大，實(shí)驗(yàn)體系的熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng).

Wavelength/nm圖3 不同濃度的Hg2+離子檢測圖

2.4 Hg2+離子檢測方法的選擇性

為了證明檢測Hg2+離子方法的選擇性，把800 nmol·L-1的Hg2+離子替換成1 mol·L-1的其它金屬離子(如Al3+，Zn2+，Mg2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+，Ca2+，Mn2+，K+，Co2+)，對其做了幾組對照實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)過程與檢測Hg2+離子的過程相同，如圖4所示，在實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，只有Hg2+離子對體系的熒光強(qiáng)度有明顯的影響.結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)對于Hg2+離子的檢測具有良好的選擇性.

圖4 Hg2+離子檢測方法的選擇性圖

2.5 Hg2+離子檢測方法的抗干擾性

為驗(yàn)證該方法對Hg2+離子的特異性識別能力，考察了其它可能產(chǎn)生干擾的一系列金屬離子的影響.如Al3+，Zn2+，Mg2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+，Ca2+，Mn2+，K+，Co2+.將800 nmol·L-1的Hg2+離子和1 mol·L-1的其它金屬離子加入到實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)Hg2+離子存在時，加入其它不同金屬離子后，體系的熒光強(qiáng)度并無明顯變化，這表明其它金屬離子不會干擾對Hg2+離子的檢測.

圖5 Hg2+離子檢測方法的抗干擾性圖

3 結(jié) 論

總之，我們基于Hg2+離子特異性地與T堿基結(jié)合，進(jìn)而ssDNA上剩余的堿基部分互相雜交形成剛性的dsDNA，被標(biāo)記的FAM基團(tuán)由于不會吸附在WS2上導(dǎo)致其熒光增強(qiáng)的原理，建立了一種檢測Hg2+離子的熒光方法.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn).同時，檢測體系對Hg2+離子表現(xiàn)出良好的選擇性，而且常見的一些陽離子也不會干擾其測定.