劉 虹，高鵬飛，叢唯一，王明超，溫 鋼，田 朕

(1.吉林化工學(xué)院 資源與環(huán)境工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林省環(huán)境科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130012；3.吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

當(dāng)今，石油對(duì)土壤、水和其他自然資源的泄漏備受關(guān)注，石油污染對(duì)人類和生態(tài)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是一個(gè)嚴(yán)重而且日益嚴(yán)重的問(wèn)題.為了解決這一環(huán)境問(wèn)題，應(yīng)用適當(dāng)?shù)奈⑸锛夹g(shù)是對(duì)有害污染物生物降解的最佳途徑之一，微生物技術(shù)即利用微生物的代謝活動(dòng)來(lái)降解污染物，減少或最終消除污染的過(guò)程[1，2].這種方法也是最有前途的方法之一，通過(guò)這種有效和環(huán)保的方式來(lái)減少污染，既能降低石油烴在生產(chǎn)、運(yùn)輸、消費(fèi)過(guò)程中對(duì)公眾健康和自然資源產(chǎn)生的危害，而且成本低又能減少二次污染[3，4].石油烴是一種復(fù)雜的混合物，含有各種烴類主要有烷烴類：正烷烴、支鏈烷烴，芳香烴，脂環(huán)烴和不飽和烴等[5].在實(shí)際石油烴污染環(huán)境的微生物修復(fù)中，不同種屬的微生物對(duì)石油烴的降解能力不同，且降解的石油烴的成分也不盡相同.目前，已報(bào)道能降解石油的微生物包括細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母及藻類,其中以細(xì)菌種類最多[6],石油烴降解細(xì)菌主要有假單胞菌[7]、無(wú)色桿菌[8]、枯草芽孢桿菌[9]、炭疽桿菌[10]、綠膿桿菌[11]等.對(duì)總石油烴效果降解大多在50%～90%間.

目前研究中關(guān)于蒼白桿菌與粘質(zhì)沙雷氏菌及其與其他混合菌對(duì)總石油烴的降解研究較少，相關(guān)報(bào)道[12，13]，粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)染料廢水處理的好氧需氧階段及促進(jìn)植物生長(zhǎng)有積極作用，主要用于藥物如紅霉素的降解及對(duì)除草劑如麥草畏的降解研究[14].本研究對(duì)煉油廢水中篩選出的2種菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn)、16S rDNA 堿基序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分類鑒定，并研究了蒼白桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)總石油烴的降解效果.為石油烴污染環(huán)境的微生物修復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持.

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

菌株來(lái)源：從含油廢水中篩選出降解石油烴的菌株，冷藏保存.

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2.

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(單位：mg/L)：(NH4)2SO42 000，K2HPO41 550，NaH2PO4850，MgCl2·6H2O 100，EDTA 10，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0，ZnSO4·7H2O 2.0，MnCl2·2H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，CuSO4·5H2O 0.2.

磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH值7.0)：39 mL 0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O溶液與61 mL 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O溶液混勻即得.

1.3 主要儀器設(shè)備

LD4-2A醫(yī)用離心機(jī)、氣相色譜儀(Agilent7890B)、手提式壓力蒸汽滅菌器、SP-DJ系列垂直凈化工作臺(tái)HZQ-QX全溫振蕩器、JMS-6700F場(chǎng)發(fā)射掃描儀、PTC-200型PCR儀(美國(guó))等.

1.4 總石油烴(簡(jiǎn)稱TPH)測(cè)試分析方法

樣品TPH采用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定

色譜條件：[注入口SPL1]：注入方式：切片；溫度：280.0 ℃；載氣：氮?dú)?空氣；流量控制方式：壓力；壓力：59.5 kpa；流量總量：37.7 mL/min；柱箱流量：1.65 mL/min；線速度：30.9 cm/sec；清洗流量：3.0 mL/min；分流比：20.0；高壓力注入：關(guān)閉；載氣保存：關(guān)閉；分流器定位：關(guān)閉.[柱箱]：初始溫度：80.0 ℃；平衡時(shí)間：3.0 min；總程序時(shí)間：31.50 min.[柱箱信息]：柱箱名：Rtx-1；序列號(hào):10124；薄膜厚度：0.25 mm；柱箱長(zhǎng)度：30.0 m；內(nèi)徑：0.32 mm ID；柱箱最大溫度：330 ℃.[檢測(cè)器通道1 DFID1]：溫度：290.0 ℃；信號(hào)采集：是；采樣速率：40 msec；停止時(shí)間：31.00 min；延遲時(shí)間：0.00 min；極性：+進(jìn)樣體積：1.0 μL.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 生理生化試驗(yàn)

分別對(duì)L2與L3菌株進(jìn)行需氧性試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V.P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、油脂水解試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶9項(xiàng)生理生化試驗(yàn).

2.1.2 16SrDNA的擴(kuò)增與測(cè)序

16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增引物：上游引物7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；下游引物1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’.

PCR擴(kuò)增條件：96 ℃預(yù)變性1 min，96 ℃變性10 sec，50 ℃退火5 sec，60 ℃延伸4 min，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后4 ℃保溫.取5 μL反應(yīng)液與1 μL 6×上樣緩沖液混合，在1%的瓊脂糖凝膠中，于150 V電壓下電泳檢測(cè).

引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成.

2.2 菌株降解石油烴效果、

取13個(gè)150 mL錐形瓶中分別加入50 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液、200 mg 0#石油.其中1個(gè)不加菌作為空白對(duì)照，其余12個(gè)樣品每6個(gè)分別加入5 mL同種石油烴降解菌溶液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD600)約為0.6于120 r/min、30 ℃下振蕩培養(yǎng)6 d.每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置2組平行樣.每隔1 d取兩個(gè)不同菌株樣品，加入10 mL正己烷進(jìn)行萃取.萃取后的有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后用GC氣相色譜儀測(cè)定TPH殘留量，計(jì)算其降解率.TPH降解率公式見(jiàn)式(1)：

(1)

式中：η為TPH降解率，100%；C0為空白對(duì)照的石油烴質(zhì)量濃度，mg/L，C1為降解后的石油烴質(zhì)量濃度.

3 結(jié)果與討論

3.1 菌體生理生化試驗(yàn)特性及分子鑒定

3.1.1 生理生化特性

對(duì)L2、L3菌進(jìn)行了9項(xiàng)生理生化試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如表1所示.

表1 菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注：+陽(yáng)性，-陰性

3.1.2 菌株分子系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株16S rDNA序列輸入Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，以BLAST軟件進(jìn)行序列同源性比較，選擇同源性大于98%的基因序列，采用Bioedit和MEGA5.0軟件對(duì)L2、L3進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，500次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算自引導(dǎo)值(Bootstrap)以估計(jì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的置信度.結(jié)果如圖1、圖2所示.

圖1 L2菌基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 L3菌基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由圖1可知：L2菌與Ochrobactrum ciceri(Ca-34)進(jìn)化距離較近，結(jié)合生理生化特性，判定L2菌株在分類學(xué)屬性為：蒼白桿菌(Ochrobactrum ciceri).由圖2可知：L3菌與serratia marcescens NBRC 202204進(jìn)化距離較近，結(jié)合生理生化特性，判定L3菌株在分類學(xué)屬性為：粘質(zhì)沙雷氏菌(serratia marcescens).

相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，菌株蒼白桿菌可以利用玉米秸稈水解液中的生物聚合物不需要另外過(guò)量的磷酸鹽，可大大降低微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本[15].粘質(zhì)沙雷氏菌經(jīng)過(guò)144 h，對(duì)o-DCB的去除率可達(dá)90.41%，當(dāng)Cr(VI)初始濃度低于40 mg/L時(shí)，菌株對(duì)Cr(VI)的去除率超過(guò)80%；而當(dāng)Cr(VI)初始濃度高于40 mg/L時(shí)，菌株對(duì)Cr(VI)的去除率接近20%.對(duì)復(fù)合污染物同時(shí)具有去除作用[16].粘質(zhì)沙雷氏菌還能發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇在3.7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn),在42 h 2,3-丁二醇濃度可達(dá)151 g/L,生產(chǎn)能力為3.59 g/L·h,產(chǎn)物得率為94.97%[17].目前，關(guān)于蒼白桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌降解石油在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，因而，本文鑒定并研究?jī)煞N菌株降解石油烴效果拓寬了降解石油烴菌株的種類.

3.2 兩種菌珠菌株對(duì)石油烴降解效果對(duì)比圖

初始石油烴濃度為4 000 mg/L時(shí)，L2、L3菌株對(duì)石油烴的降解率隨時(shí)間變化如圖3所示.

t/d圖3 2種菌株對(duì)石油烴的降解率曲線

由圖3可知：由于菌株的生長(zhǎng)關(guān)系，2種菌株對(duì)石油烴的降解率在初始的2天處于對(duì)數(shù)期菌株以石油烴類為唯一碳源，菌株生長(zhǎng)較快，酶活性也較高，增加較快，因此，對(duì)石油烴的降解率高.而3 d后菌株生長(zhǎng)較為緩慢，因而，降解能力逐漸降低.6 d后，L2與L3 2種菌株對(duì)石油烴的降解率分別達(dá)到97.37%和98.98%.說(shuō)明2種單菌對(duì)石油烴污染環(huán)境具有很強(qiáng)的生物修復(fù)潛力.

3.3 兩種菌株降解石油烴氣相色譜圖

將空白組和各單菌降解石油烴6d后的樣品進(jìn)行氣相色譜測(cè)定后，所得空白對(duì)照和L2、L3菌降解后的石油烴樣品測(cè)定結(jié)果如圖4，圖5和圖6所示.

t/min圖4 石油烴氣相色譜圖(未降解前)

t/min圖5 L2菌對(duì)石油烴降解6 d后氣相色譜圖

t/min圖6 L3菌對(duì)石油烴降解6 d后氣相色譜圖

從圖4、圖5和圖6可以看出L2、L3菌株對(duì)石油烴降解效果非常明顯.石油其主要成分是碳?xì)錁?gòu)成的烴類化合物，烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴約占石油成分的95%以上，絕大部分均可被微生物代謝降解[18，19].不同菌屬的微生物對(duì)石油的降解能力也不同，石油烴本身性質(zhì)也會(huì)對(duì)降解產(chǎn)生影響.一般認(rèn)為，不同烴類化合物的降解率如下：小于C10的直鏈烷烴>C10-C24或更長(zhǎng)的直鏈烷烴>小于C10的支鏈烷烴>C10-C24或更長(zhǎng)的支鏈烷烴>單環(huán)芳烴>多環(huán)芳烴>雜環(huán)芳烴.低硫、高飽和烴的粗油最易降解，而高硫、高芳香族烴類化合物的純油則最難降解[20].烷烴的降解途徑主要有單一末端氧化、雙末端氧化或ω-氧化、次末端氧化3種方式.上述兩種高效石油烴降解菌株為其在石油烴污染環(huán)境的生物修復(fù)方面提供了新的參考理論依據(jù).

4 結(jié) 論

采用16S rDNA技術(shù)對(duì)煉油廢水中篩選出的2種菌進(jìn)行鑒定，經(jīng)生理生化特性及16S rDNA鑒定2種菌在分類學(xué)上L2、L3分別屬于蒼白桿菌(Ochrobactrum ciceri sp.)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens sp.).

將2種菌株用于石油烴降解，初始濃度為4 000 mg/L的石油，加入該菌株，120 r/min、30 ℃下振蕩培養(yǎng)6 d后石油烴降解率高達(dá)97.37%和98.98%.