異源表達(dá)Hvsusiba2水稻對(duì)稻田甲烷排放及土壤相關(guān)菌群的影響*

蘇 軍, 單 貞, 陳在杰

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異源表達(dá)2水稻對(duì)稻田甲烷排放及土壤相關(guān)菌群的影響*

蘇 軍, 單 貞, 陳在杰

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所/福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350003)

2是調(diào)控大麥淀粉合成和光合產(chǎn)物分配的轉(zhuǎn)錄因子。前期研究我們將2導(dǎo)入粳稻L.subsp),2粳稻稻田甲烷排放顯著下降, 胚乳淀粉含量顯著提高。為進(jìn)一步明確2對(duì)稻田甲烷排放的影響, 本研究我們將2導(dǎo)入秈稻(L.subsp.), 研究異源表達(dá)2秈稻全生育期甲烷排放和稻田主要甲烷菌及甲烷氧化菌變化。采用靜態(tài)箱法測定2水稻稻田甲烷排放通量, 結(jié)果顯示2稻田全生育期的大部分時(shí)段甲烷排放量顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)低于對(duì)照株系。2水稻甲烷減排率幅度為54.7%~3.8%, 減排率最高的時(shí)期為幼穗分化期。2個(gè)2水稻株系生長季累計(jì)甲烷排放量分別為5 060.16mg×m-2和5 250.60 mg×m-2, 比對(duì)照減排30.30%和27.58%。采用熒光定量PCR法檢測水稻關(guān)鍵生長期根土6類產(chǎn)甲烷菌和2類甲烷氧化菌以及土壤總細(xì)菌的豐度變化。結(jié)果顯示: 在整個(gè)生長期內(nèi)2水稻根土6類產(chǎn)甲烷菌菌群豐度的總體趨勢(shì)是前期高、后期低; 甲烷古菌(Archaea,ARC)、甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae,Mst)和甲烷微菌目(Methanomicrobiales,MMb)3類菌群豐度的高峰出現(xiàn)在分蘗盛期, 甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae,Msc)菌群豐度的高峰出現(xiàn)在幼穗分化穗期, 普通產(chǎn)甲烷菌(Methanogens,MET)和甲烷桿菌目(Methanobacteriales, MBT)分蘗期最高。2水稻產(chǎn)甲烷菌豐度在分蘗期、抽穗期和開花期顯著或極顯著地低于野生型對(duì)照。在大部分測試時(shí)間段內(nèi)2水稻的2類甲烷氧化菌群豐度比對(duì)照有顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)下降;2水稻土壤總細(xì)菌豐度在水稻的分蘗期、抽穗期和開花期也顯著低于野生型水稻。稻田中產(chǎn)甲烷菌的豐度依次是甲烷鬃菌科(Mst)>甲烷古菌(ARC)>普通產(chǎn)甲烷菌(MET)>甲烷微菌目(MMb)≥甲烷八疊球菌科(Msc)>甲烷桿菌目(MBT); 2類甲烷氧化菌中Ⅰ型甲烷氧化菌(MBAC)豐度極顯著大于Ⅱ型甲烷氧化菌(TYPEⅡ)。結(jié)合之前的研究結(jié)果, 我們認(rèn)為2可能是通過改變水稻光合同化物分配生理, 減少向土壤有機(jī)質(zhì)的輸送, 降低土壤相關(guān)菌群的豐度達(dá)到稻田甲烷減排的。

水稻;2異源表達(dá); 甲烷減排; 產(chǎn)甲烷菌; 甲烷氧化菌; 菌群豐度

稻田是最重要的農(nóng)業(yè)甲烷排放源之一[1], 估計(jì)每年向大氣中排放甲烷達(dá)50~60 Tg[2]。稻田甲烷排放包括甲烷產(chǎn)生、氧化和釋放3個(gè)環(huán)節(jié)[3-7]。水稻(L.)生長過程中根系分泌的有機(jī)酸連同根脫落物在土壤微生物的作用下轉(zhuǎn)變成為可被產(chǎn)甲烷菌利用的底物, 如CO2、H2、乙酸鹽等簡單分子。在厭氧條件下, 產(chǎn)甲烷菌利用這些小分子物質(zhì)產(chǎn)生甲烷。所產(chǎn)生的甲烷大部分被根際土壤中的甲烷氧化菌氧化消耗, 剩余的少部分甲烷通過淹水層或者水稻植株通氣組織排放到大氣中去。通過這一系列復(fù)雜而又微妙的過程構(gòu)成整個(gè)稻田甲烷的循環(huán)。

在稻田甲烷的循環(huán)系統(tǒng)中, 水稻品種、產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌是決定稻田甲烷產(chǎn)生和排放的關(guān)鍵因素。連接這3個(gè)因素的是土壤中的碳(碳庫), 水稻品種通過根將光合同化碳以有機(jī)酸形式分泌到土壤中, 產(chǎn)甲烷菌以土壤中的碳為生存和繁殖的基質(zhì)代謝產(chǎn)生甲烷, 甲烷氧化菌以甲烷為底物氧化消耗甲烷, 未被消耗的甲烷通過植株通道排放到大氣中。因此, 水稻品種遺傳背景所決定的根系結(jié)構(gòu)和生理以及光合代謝特征不僅影響了甲烷底物的供給和甲烷排放的通道特性, 也影響了甲烷相關(guān)菌的豐度、結(jié)構(gòu)及活性[8-10], 最終疊加作用于甲烷排放。由品種因素造成的甲烷排放差異可達(dá)1.5~3.5倍[11-12]。因此如果改變水稻根系的生物量和生理特征、莖的形態(tài)結(jié)構(gòu)或者水稻光合產(chǎn)物分配, 就有可能相應(yīng)地改變土壤中的碳含量, 繼而降低稻田甲烷排放。基于此, 我們?cè)O(shè)想通過調(diào)控水稻光合產(chǎn)物的分配, 即增加光合產(chǎn)物在地上部的分配, 減少光合產(chǎn)物地下部的分配有可能減少稻田甲烷的排放。前期研究我們將一個(gè)來源于大麥(L.)的轉(zhuǎn)錄因子2構(gòu)建在淀粉合成基因特異啟動(dòng)子的下游, 利用啟動(dòng)子在籽粒中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的特性, 增加水稻種子淀粉含量, 調(diào)控水稻植株體內(nèi)碳水化合物分配, 降低稻田甲烷排放[13]。初步證實(shí)了我們的設(shè)想。由于前期研究所用的材料為水稻模式品種‘日本晴’(subsp.), 該品種屬于粳稻亞種, 與目前南方廣大稻區(qū)種植的秈稻亞種(subsp.)遺傳背景有較大差異。本研究我們將該基因?qū)攵i稻, 研究該基因表達(dá)對(duì)秈稻稻田土壤甲烷排放的影響, 進(jìn)一步理解2基因在不同遺傳背景下對(duì)稻田甲烷減排的效果, 同時(shí)通過對(duì)水稻生長期產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的種群豐度變化的檢測, 探討2水稻甲烷減排的機(jī)制, 探索通過生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)稻田甲烷減排的新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻品種: 轉(zhuǎn)2基因水稻純合株系‘86R10-1’和‘86R27-3’及其野生型秈稻‘MH86’。

質(zhì)粒: 含有產(chǎn)甲烷菌或甲烷氧化菌16S rRNA的pMD-18T載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌, 由福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻種植

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理(株系), 每個(gè)處理30株, 3次重復(fù), 隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)。試驗(yàn)地點(diǎn)為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院福州壽山試驗(yàn)站(26°00￠N, 119°18￠E)。試驗(yàn)時(shí)間為2016年4月28日—9月23日。4月28日浸種, 2日后37 ℃溫箱催芽, 5月7日育秧, 6月8日移栽。單本插, 株行距35 cm×35 cm。試驗(yàn)地四周栽種4行水稻作為保護(hù)行。田間水肥管理按當(dāng)?shù)毓芾矸绞? 僅施無機(jī)肥。整個(gè)生長季稻田保持水層5 cm淹水狀態(tài)。為避免采集氣體時(shí)擾動(dòng)土壤造成采氣不準(zhǔn)確, 在試驗(yàn)田中安裝兩座木橋, 方便搬運(yùn)器材及采氣; 同時(shí), 為避免采氣過程中搬動(dòng)靜態(tài)箱而擾動(dòng)植株, 在水稻移栽1周后, 在待測植株上安裝特制的鐵質(zhì)基座, 保護(hù)水稻及根部土壤。

1.2.2 氣體采集及檢測

插秧后3周開始第1次氣體采集, 之后每周采集1 d, 每個(gè)采集日上午和下午各1次, 直到水稻成熟, 如遇臺(tái)風(fēng)、大雨等惡劣天氣, 則采氣工作順延至下一個(gè)晴天。以1株為一個(gè)采集單位。每個(gè)重復(fù)采集2份樣品, 3次重復(fù), 即每個(gè)株系共6份樣品。從罩上集氣裝置開始計(jì)時(shí), 在10 min、20 min、30 min時(shí)各采集30 mL氣體, 每個(gè)單位植株的3個(gè)時(shí)段樣品(共90 mL)混裝在同一鋁箔復(fù)合膜密閉氣袋中, 采集后的樣品放置4 ℃保存待測。采集時(shí)間為2016年6—9月, 上午采氣時(shí)間為10:00—12:30, 下午為14:30—17:00, 過程中記錄靜態(tài)箱內(nèi)溫度、水稻生長發(fā)育階段。采集的氣體用Agilent 7890B氣相色譜儀檢測甲烷, 以純甲烷作為標(biāo)準(zhǔn)氣體, 檢測器為前檢測器FID; 載氣(He)流量1 mL×min-1, 尾吹氣(N2)流量25 mL×min-1, 燃?xì)?H2)流量30 mL×min-1, 空氣流量400 mL×min-1; 柱箱溫度70 ℃,檢測溫度250 ℃;出峰時(shí)間2.9 min。甲烷通量按以下公式計(jì)算:

273(273) (1)

式中:表示甲烷氣體通量(mg·m-2·h-1),表示標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下甲烷的氣體密度,為靜態(tài)箱的箱高(),表示靜態(tài)箱內(nèi)甲烷氣體濃度變化率(%),表示采集過程中靜態(tài)箱內(nèi)的平均溫度(℃)。采用最小二乘法計(jì)算生長季累計(jì)排放量, 按下列公式計(jì)算生長季減排率: 生長季減排率=(對(duì)照累計(jì)排放量-處理累計(jì)排放量)/對(duì)照累計(jì)排放量×100%

1.2.3 水稻根土采集及土壤總DNA提取

選與氣體樣品采集植株生長一致的相鄰植株為采樣株, 用土壤采樣器等量采集水稻植株4個(gè)不同方向土壤, 采樣點(diǎn)距離水稻根部水平距離5 cm、垂直距離地表5 cm, 4份土壤樣品均勻地混合為1組, 3組重復(fù)。采集時(shí)間為氣體采集日當(dāng)天14:00—14:30, 采集后的土壤放入干凈的自封袋, 4 ℃放置。帶回實(shí)驗(yàn)室后-20 ℃暫時(shí)儲(chǔ)藏, 1周內(nèi)提取土壤總DNA。

土壤DNA提取: 準(zhǔn)確稱取1.0 g土壤樣品2份, 一份裝入2 mL EP管烘干測定土壤水分, 另一份裝入試劑盒提供的Lysing Matrix ETube, 用于提取土壤總DNA。土壤總DNA提取采用Fast DNA? SPIN Kit for Soil試劑盒提供的方法。用核酸定量儀檢測土壤總DNA濃度, 將所提土壤總DNA稀釋至100 ng?μL-1, 并放置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品制備, 分別提取不同菌種的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒, 用核酸定量儀檢測質(zhì)粒濃度, 加入ddH2O將樣品調(diào)整至1×1010copy×L-1作為原液。

1.2.4 根土產(chǎn)甲烷菌及甲烷氧化菌定量分析

根據(jù)文獻(xiàn), 選稻田中常見的6類產(chǎn)甲烷菌群和2類甲烷氧化優(yōu)勢(shì)菌群以及土壤總細(xì)菌為檢測目標(biāo)。6對(duì)引物對(duì)應(yīng)的產(chǎn)甲烷菌分別是: 甲烷古菌域Archaea (ARC)、產(chǎn)甲烷菌Methanogens (MET)、甲烷微菌目Methanomicrobiales (MMb)、甲烷桿菌目Methanobac-teriales (MBT)、甲烷八疊球菌科Methanosarcinaceae(Msc)和甲烷鬃菌科Methanosaetaceae (Mst), 其中的ARC和MET與所測定的其他產(chǎn)甲烷菌群有部分重疊。2對(duì)甲烷氧化菌引物對(duì)應(yīng)的甲烷氧化菌為: Ⅰ型甲烷氧化菌Methytobacter/Met-hylosarcina (MBAC)和Ⅱ型甲烷氧化菌Methylosinus (TYPEII); 土壤總細(xì)菌用土壤細(xì)菌通用引物擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[14-17], 詳見表1。

采用熒光定量PCR法分別在水稻分蘗期、幼穗分化期、開花期、灌漿期和成熟期等關(guān)鍵時(shí)期測定稻田土壤菌群豐度。PCR反應(yīng)體系如下: SYBR 10 μL、濃度為0.2 μmol×L-1引物各1 μL、濃度為100 ng×μL-1DNA 1 μL、加水補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增程序見表2。每份DNA均做3次平行重復(fù)。上述不同菌標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)粒梯度稀釋, 制備及擴(kuò)增102~108copy×L-1的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品, 建立各菌對(duì)應(yīng)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增所得CT值計(jì)算單位樣品中的基因拷貝數(shù), 再根據(jù)土壤水分比換算得到單位干土中菌的含量[×106copies×g-1(DWS)]。

表1 產(chǎn)甲烷菌(群)和甲烷氧化菌(群)16S rRNA熒光定量PCR引物

表2 產(chǎn)甲烷菌(群)和甲烷氧化菌(群)熒光定量PCR擴(kuò)增程序

Table 2 qPCR programs for 6 methanogens and 2 methanotrophs

N: 產(chǎn)甲烷菌退火溫度, ARC為60 ℃, Msc為60 ℃, Mst為61 ℃, MMb為66 ℃, MBT為58 ℃, Met為60 ℃。M: 甲烷氧化菌退火溫度, MBAC為58 ℃, TYPEⅡ?yàn)?5 ℃。N and M: PCR annealing temperature for methanogens andmethanotrophs, for ARC it is 60 ℃, for Msc it is 60 ℃, for Mst it is 61 ℃, for MMb it is 66 ℃, for MBT it is 58 ℃, for Met it is 60 ℃, for MBAC it is 58 ℃, for TYPEⅡ it is 65 ℃.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及作圖

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel進(jìn)行初步計(jì)算, 用SPSS(version 19.0; IBM)進(jìn)行顯著性分析, Excel制圖。

2 結(jié)果分析

2.1 Hvsusiba2秈稻稻田甲烷排放特征分析

稻田甲烷排放特征見圖1。2個(gè)表達(dá)2秈稻株系全生育期稻田甲烷排放趨勢(shì)基本與對(duì)照相似。表現(xiàn)為隨著水稻生長, 甲烷排放趨勢(shì)呈波動(dòng)狀態(tài)上升。上午時(shí)段2個(gè)高峰期分別出現(xiàn)在幼穗分化期(播種后72 d)和開花灌漿期(播種后98 d )(圖1A)。下午時(shí)段的排放趨勢(shì)與上午時(shí)段略有不同, 對(duì)照‘MH86’有3個(gè)明顯的高峰期分別出現(xiàn)在分蘗期(播種后59 d)、幼穗分化期(播種后78 d)和開花灌漿期(播種后98 d);2株系的甲烷排放趨勢(shì)較緩和, 峰值較低(圖1B)。不論是上午時(shí)段或下午時(shí)段,2水稻全生育期稻田甲烷排放量都明顯低于對(duì)照‘MH86’, 在分蘗期、抽穗期、開花期以及灌漿期等生長旺盛期顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)低于對(duì)照(圖1A, B)?！?6R10-1’株系全生育期甲烷減排率幅度為54.7%~3.8%, 減排率最高的時(shí)期為幼穗分化期(播種后78 d)和成熟期(播種后118 d), 減排率分別達(dá)到54.7%和52.1%?！?6R27-3’全生育期甲烷減排率幅度范圍和最高減排時(shí)期與‘86R10-1’株系相似。

圖1 播種后不同時(shí)間Hvsusiba2秈稻‘86R10-1’和‘86R27-3’稻田不同時(shí)段甲烷排放特征

A:10:00—12:30采集的樣品; B: 14:30—17:00采集的樣品。每個(gè)值是6個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值。*和**分別表示2秈稻和對(duì)照‘MH86’的差異顯著性達(dá)5%和1%水平。Figures A are samples collected at 10:00-12:30. Figures B are samples collected at 14:30-17:00. Each value is the mean of 6 biological replicates. * and ** indicate significance differences between2 indica rice and wild rice ‘MH86’ at 5% and 1% levels, respectively.

生長季累計(jì)排放量按第一次采氣到最后一次采氣的間隔時(shí)間73 d天計(jì)算, ‘86R10-1’生長季累計(jì)排放量為5 057.16 mg×m-2, ‘86R27-3’為5 250.24 mg×m-2, 對(duì)照‘MH86’累計(jì)排放量為7 249.68 mg×m-2, 2個(gè)2秈稻折算減排率分別為30.20%和27.60%。

2.2 表達(dá)Hvsusiba2秈稻全生育期根土總細(xì)菌的豐度變化

水稻根系分泌的有機(jī)酸及根脫落物等大分子有機(jī)物, 需要一系列細(xì)菌降解消化成H2、CO2、乙酸、甲醇等小分子物質(zhì), 才能進(jìn)一步被甲烷菌所利用。這些細(xì)菌參與了包括甲烷前體形成的水解、發(fā)酵、纖維素降解、硫酸鹽還原、互營、產(chǎn)酸產(chǎn)氣等生化過程, 是甲烷產(chǎn)生過程中重要細(xì)菌[17]。甲烷是這一系列生化反應(yīng)的終產(chǎn)物, 研究這些細(xì)菌的豐度和結(jié)構(gòu)是評(píng)價(jià)甲烷排放的重要參數(shù)。2秈稻土壤中總細(xì)菌的豐度達(dá)到1011數(shù)量級(jí), 高于甲烷菌109和甲烷氧化菌1010數(shù)量級(jí)。在水稻全生育期的變化趨勢(shì)為分蘗期(播種后59 d)最高, 之后迅速下降。2秈稻土壤細(xì)菌在分蘗期(播種后52 d, 播種后59 d)、幼穗分化期(播種后78 d)以及開花期(播種后92 d)顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)低于對(duì)照‘MH86’, 但灌漿期(播種后105 d)和成熟期(播種后111 d)與對(duì)照沒有差異(圖2)。2個(gè)秈稻株系全生育期土壤總細(xì)菌平均豐度分別為(31.82±3.70)×1010copies?g-1(DWS)和(33.71±5.10)×1010copies?g-1(DWS), 顯著(<0.05)低于野生型‘MH86’的(42.59±4.38)×1010copies?g-1(DWS)。

圖2 Hvsusiba2秈稻‘86R10-1’和‘86R27-3’不同生育期根土總細(xì)菌豐度

每個(gè)值是3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值; *和**分別表示2秈稻和對(duì)照‘MH86’的差異達(dá)5%和1%水平。Each value is the mean of 3 biological replicates. * and ** mean significant differences between2 indica rice and wild rice ‘MH86’ at 5% and 1% levels, respectively.

2.3 Hvsusiba2秈稻全生育期根土6類產(chǎn)甲烷菌豐度動(dòng)態(tài)變化

2個(gè)2水稻株系6類產(chǎn)甲烷菌豐度變化呈現(xiàn)出與水稻生長發(fā)育期密切相關(guān)的動(dòng)態(tài)關(guān)系(圖3)。總體是前期高、后期低, 但不同菌群表現(xiàn)不盡相同。其中ARCMst和MMb菌群豐度的高峰出現(xiàn)在分蘗期(播種后59 d), Msc出現(xiàn)在幼穗分化穗期(播種后78 d), MET和MBT幾乎是分蘗期(播種后52 d)最高。隨著生育期的推進(jìn), 所有菌群豐度逐漸下降, 除Msc在灌漿期(播種后105 d)最低外, 其余菌群在開花灌漿期(播種后92 d)豐度最低, 成熟期又略有上升。與對(duì)照‘MH86’相比, 除Mst在灌漿和成熟期與對(duì)照沒有顯著差異外, 2個(gè)2秈稻株系全生育期根土5類產(chǎn)甲烷菌豐度在水稻整個(gè)生育期的大部分時(shí)段均顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)下降。

圖3 表達(dá)Hvsusiba2秈稻‘86R10-1’和‘86R27-3’全生育期稻田根土6類產(chǎn)甲烷菌豐度變化

每個(gè)值是3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值; *和**分別表示2秈稻和對(duì)照‘MH86’的差異達(dá)5%和1%水平。Each value is the mean of 3 biological replicates. * and ** mean significant differences between2 indica rice and wild rice ‘MH86’ at 5% and 1% levels, respectively.

進(jìn)一步分析表明, ‘86R10-1’根土產(chǎn)甲烷菌群量與對(duì)照相比, Mst、ARC和MBT最大減少量出現(xiàn)在分蘗期(播種后59 d), 分別為(1 599.00±282.45)×106copies?g-1(DWS)、(131.80±14.75)×106copies?g-1(DWS)和(0.12±0.01)×106copies?g-1(DWS); ‘86R27-3’的Mst、ARC和MBT的減少量則為(1 707.40±257.60)×106copies?g-1(DWS)、(138.85±34.42)×106copies?g-1(DWS)和(0.15±0.01)×106copies?g-1(DWS)。其余各生長期也都有不同程度減少; 2個(gè)株系Msc最大減少量則出現(xiàn)在幼穗分化期(播種后78 d), 分別為(4.09±0.24)×106copies?g-1(DWS)和(4.54±0.28)×106copies?g-1(DWS)。

將不同水稻株系同時(shí)期的土壤產(chǎn)甲烷菌總和與同期總細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較(圖4), 結(jié)果顯示, 大部分測定期內(nèi)2個(gè)2株系稻田土壤甲烷菌與總細(xì)菌的相對(duì)值比對(duì)照‘MH86’顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)下降。雖然2水稻土壤產(chǎn)甲烷菌和總細(xì)菌豐度都顯著下降(<0.05), 但2水稻土壤中產(chǎn)甲烷菌在總細(xì)菌中的占比下降, 說明2水稻對(duì)產(chǎn)甲烷菌的影響要大于對(duì)總細(xì)菌的影響。

圖4 Hvsusiba2秈稻‘86R10-1’和‘86R27-3’全生育期稻田土壤產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度(產(chǎn)甲烷菌/總細(xì)菌)

每個(gè)值是3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值; *和**分別表示2秈稻和對(duì)照‘MH86’的差異達(dá)5%和1%水平。Each value is the mean of 3 biological replicates. * and ** mean significant differences between2 indica rice and wild rice ‘MH86’ at 5% and 1% levels, respectively.

2.4 表達(dá)Hvsusiba2秈稻全生育期根土2類甲烷氧化菌豐度動(dòng)態(tài)變化

2秈稻根土中2類甲烷氧化菌群MBAC和TYPEⅡ動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)如圖5所示。2個(gè)2株系全生育期的MBAC豐度變化趨勢(shì)與對(duì)照‘MH86’不一致, ‘86R10-1’和‘86R27-3’在分蘗期(播種后52 d)最高, 隨著水稻生長進(jìn)程, 逐漸下降, 在開花灌漿期(播種后92 d)最低, 后期略有提升; 而對(duì)照‘MH86’在分蘗期(播種后59 d)達(dá)到高峰, 之后逐漸下降, 在開花灌漿期(播種后92 d)降到最低, 之后又上升, 在灌漿期(播種后105 d)再次出現(xiàn)一個(gè)峰?！?6R10-1’和‘86R27-3’株系生育期內(nèi)TYPEⅡ菌群的變化趨勢(shì)與對(duì)照類似, 分蘗期和幼穗分化期較高?？傮w而言, 在大部分測試時(shí)段內(nèi)2秈稻的2類甲烷氧化菌群豐度比對(duì)照有顯著(<0.05)或極顯著下降(<0.01)。

圖5 Hvsusiba2秈稻‘86R10-1’和‘86R27-3’稻田土壤2類甲烷氧化菌豐度變化

每個(gè)值是3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值; *和**分別表示2秈稻和對(duì)照‘MH86’的差異達(dá)5%和1%水平。Each value is the mean of 3 biological replicates. * and ** mean significant differences between2 indica rice and wild rice ‘MH86’ at 5% and 1% levels, respectively.

‘86R10-1’和‘86R27-3’水稻根土中MBAC最大減少量出現(xiàn)在分蘗期(播種后59 d), 分別為(16 381.00± 2 092.10)×106copies?g-1(DWS)和(21 038.00±2 092.10)× 106copies?g-1(DWS)?！?6R10-1’和‘86R27-3’水稻根土中TYPEⅡ在根土中的最大減少量出現(xiàn)在幼穗分化期(播種后78 d), 分別為(6.00±3.63)×106copies?g-1(DWS)和(9.06±2.00)×106copies?g-1(DWS)。

從甲烷菌/甲烷氧化菌相對(duì)豐度看,2水稻甲烷菌/甲烷氧化菌比值顯著提高(圖6), 說明2水稻土壤甲烷氧化菌的降幅比產(chǎn)甲烷菌降幅大。甲烷氧化菌是以甲烷為惟一底物的土壤細(xì)菌, 甲烷氧化菌豐度減少, 表明土壤中可利用的甲烷濃度降低, 限制了甲烷氧化菌種群的繁殖。說明2水稻田甲烷減排的原因是甲烷產(chǎn)量降低了, 而非甲烷氧化消耗增加所致。

2.5 Hvsusiba2秈稻根土6類產(chǎn)甲烷菌和2類甲烷氧化菌結(jié)構(gòu)

產(chǎn)甲烷菌是一個(gè)龐大的微生物種群, 目前已經(jīng)鑒定了34個(gè)屬的甲烷菌, 分屬于7個(gè)目[18]。對(duì)6類稻田土壤常見產(chǎn)甲烷菌的檢測顯示: 整個(gè)生育期內(nèi), 水稻根土甲烷菌群平均豐度依次為甲烷鬃菌科(Mst)>古細(xì)菌域甲烷菌(ARC)>普通甲烷菌(MET)>甲烷微菌目(MMb)≥甲烷八疊球菌科(Msc)>甲烷桿菌目(MBT) (表3)。其中甲烷鬃菌為優(yōu)勢(shì)菌群, 在分蘗期可達(dá)109拷貝數(shù), 甲烷古菌位于其次達(dá)到108拷貝數(shù), 普通甲烷菌為107拷貝數(shù), 豐度最低的是甲烷桿菌目僅105拷貝數(shù)。2個(gè)2株系菌群的群落結(jié)構(gòu)與對(duì)照相比沒有差異。

圖6 Hvsusiba2秈稻‘86R10-1’和‘86R27-3’全生育期稻田土壤產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度(產(chǎn)甲烷菌/甲烷氧化菌)

每個(gè)值是3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值; *和**分別表示2秈稻和對(duì)照‘MH86’的差異達(dá)5%和1%水平。Each value is the mean of 3 biological replicates. * and ** mean significant differences between2 indica rice and wild rice ‘MH86’ at 5% and 1% levels, respectively.

甲烷氧化菌是以甲烷為惟一碳源的功能微生物。主要有2類, 分別是MBAC和TypeⅡ。2秈稻根土中MBAC的豐度要極顯著大于TYPEⅡ(表4), 達(dá)109~1010拷貝數(shù), 而TYPEII僅為106~107拷貝數(shù)。表明2秈稻稻田中主導(dǎo)甲烷氧化菌群是MBAC, 占據(jù)壓倒性優(yōu)勢(shì)。

此外, 結(jié)果還提示: ‘86R10-1’和‘86R27-3’株系與‘MH86’相比在生育期內(nèi)各個(gè)階段根土6類產(chǎn)甲烷菌和2類甲烷氧化菌豐度的位次順序沒有差異。

表3 6類甲烷菌在Hvsusiba2秈稻田土壤總甲烷菌中的比例

表4 2類甲烷氧化菌在Hvsusiba2秈稻田土壤中的比例

3 討論和結(jié)論

水稻植株在稻田甲烷排放過程中起著十分重要的作用, 它既是稻田甲烷產(chǎn)生的基質(zhì)供應(yīng)者, 又是甲烷排放的主要通道[5]。因此不同品種植株形態(tài)和光合生理差異對(duì)稻田甲烷的排放有顯著影響。由品種因素造成的甲烷排放差異可達(dá)1.5~3.5倍[11-12]。現(xiàn)代分子生物學(xué)表明: 通過基因操作是可以改變植株形態(tài)或光合生理的, 因此理論上通過基因操作降低甲烷排放是可能的。基于此, 我們將2基因?qū)胨? 探討生物技術(shù)降低稻田甲烷排放的可行性。2是一個(gè)糖信號(hào)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(sugar signaling in barley,2), 能夠被蔗糖信號(hào)誘導(dǎo)激活, 激活后的2通過綁定大麥異淀粉酶基因(,ISO1)啟動(dòng)子區(qū)的SURE元件和序列, 調(diào)控異淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄水平, 促進(jìn)淀粉合成[19-20]。我們將2構(gòu)建在淀粉分支酶基因(,SBE)啟動(dòng)子p下游, 利用p啟動(dòng)子胚乳優(yōu)勢(shì)表達(dá)特性, 驅(qū)動(dòng)2在胚乳表達(dá), 促進(jìn)胚乳淀粉累積, 目的是促進(jìn)碳水化合物向籽粒運(yùn)送, 減少向地下運(yùn)送, 達(dá)到甲烷減排的效果。從甲烷排放趨勢(shì)看, 全生育期稻田甲烷排放量都顯著低于對(duì)照品種。結(jié)合2對(duì)粳稻‘日本晴’稻田甲烷減排的結(jié)果[13], 進(jìn)一步證實(shí)了2降低水稻田甲烷排放量是可行的, 并且在不同的水稻遺傳背景中的作用是穩(wěn)定的。

稻田甲烷排放是產(chǎn)甲烷菌、甲烷氧化菌以及其他相關(guān)細(xì)菌共同作用后的結(jié)果。產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌位于土壤碳循環(huán)的末端, 產(chǎn)甲烷菌只能以CO2、H2、乙酸、甲酸等簡單分子為底物[21], 土壤有機(jī)質(zhì)必須降解成簡單分子后才能被產(chǎn)甲烷菌利用。有機(jī)質(zhì)的降解過程需要包括發(fā)酵、降解、酸化等眾多微生物協(xié)同作用。稻田土壤總細(xì)菌豐度下降意味著這些功能菌群數(shù)量下降, 其結(jié)果是有機(jī)物的降解能力下降, 產(chǎn)甲烷底物供給量減少, 影響甲烷的生成。土壤總細(xì)菌下降也暗示土壤中供給微生物繁殖所需的有機(jī)物含量減少。稻田土壤有機(jī)質(zhì)一般由兩部分組成, 一部分是前茬作物及土壤原有有機(jī)質(zhì)構(gòu)成的本底, 另一部分是當(dāng)季水稻生長過程中向土壤輸入的新增有機(jī)質(zhì), 在水稻生長過程中如果沒有外加有機(jī)質(zhì), 稻田土壤有機(jī)物質(zhì)增量主要來源于水稻根分泌物和脫落物[22]。2水稻稻田土壤總細(xì)菌豐度下降, 表明當(dāng)季水稻向土壤輸入的有機(jī)碳減少。

稻田土壤甲烷菌群落豐度變化也一定程度上反映了水稻根系向土壤輸入有機(jī)物的能力。2水稻各個(gè)生長期內(nèi)產(chǎn)甲烷菌豐度低于野生型對(duì)照, 暗示2水稻在整個(gè)生長期根系向土壤輸入有機(jī)物量都要低于野生型對(duì)照。該結(jié)果與2具有調(diào)控水稻光合產(chǎn)物分配、增加莖和胚乳總淀粉含量、減少水稻地下部生物量[13]的功能相符。2稻田土壤總細(xì)菌、甲烷菌和甲烷氧化菌豐度都顯著下降, 但并不是等比例下降, 其中產(chǎn)甲烷菌豐度降低幅度大于總細(xì)菌降低幅度, 甲烷氧化菌豐度降低幅度大于甲烷菌降低幅度, 菌群的豐度下降幅度隨甲烷代謝鏈下移而增大。我們分析這是由于土壤中含碳有機(jī)物減少引發(fā)的作用首先影響的是與碳代謝有關(guān)的菌群的繁殖, 產(chǎn)甲烷菌是有機(jī)物厭氧降解的末端功能菌群[23], 甲烷氧化菌是以甲烷為惟一底物的氧化菌[24], 兩者都是土壤碳代謝下游的菌群, 土壤有機(jī)物減少對(duì)細(xì)菌的影響作用傳導(dǎo)到甲烷代謝鏈末端菌的作用是累積的。

根據(jù)以上分析我們推斷: 導(dǎo)致2水稻甲烷減排的主要原因是稻田土壤甲烷菌群豐度下降, 而造成甲烷菌群豐度下降的因素是土壤中產(chǎn)甲烷基質(zhì)減少, 結(jié)合前期對(duì)2水稻光合生理以及基因表達(dá)分析[13], 我們認(rèn)為2基因異源表達(dá)降低水稻甲烷排放的機(jī)制是光合產(chǎn)物的分配發(fā)生變化, 光合產(chǎn)物向地下部的運(yùn)送減少, 導(dǎo)致甲烷相關(guān)菌群豐度下降, 甲烷產(chǎn)生量減少, 相應(yīng)地達(dá)到甲烷減排的效果。當(dāng)然, 這些研究只是提供了間接的證據(jù), 進(jìn)一步的證據(jù)還有待于對(duì)水稻根系分泌物以及稻田土壤輸入性碳進(jìn)行跟蹤分析。

雖然來自田間測定數(shù)據(jù)顯示2水稻甲烷排放顯著下降、甲烷菌群豐度也顯著下降, 但二者在對(duì)應(yīng)的時(shí)間上沒有顯著相關(guān)性(數(shù)據(jù)未列出)。所測定的6類主要產(chǎn)甲烷菌中, 5類峰值出現(xiàn)在水稻生長分蘗期, 而甲烷排放的高峰期則在分蘗期至灌漿期之間。甲烷排放高峰期明顯滯后于產(chǎn)甲烷菌的旺盛生長期。究其原因我們認(rèn)為是稻田甲烷排放除與土壤中甲烷相關(guān)菌和基質(zhì)有關(guān)外, 還受土壤中氧化還原電位、土壤溫度、pH等諸多因素的影響, 因素與因素之間相互交織互相影響, 任何一個(gè)因素的變化, 都會(huì)導(dǎo)致其他所有因素發(fā)生變化, 最終導(dǎo)致系統(tǒng)性變化。王明星[25]研究也發(fā)現(xiàn): 水稻生長季甲烷菌的數(shù)量不是甲烷產(chǎn)量變化的原因。此外, 我們檢測甲烷菌豐度是基于16S rRNA定量法, 所獲得的是菌群拷貝數(shù)數(shù)據(jù), 而非菌群的活性數(shù)據(jù), 而甲烷產(chǎn)量與甲烷菌群的活性關(guān)系更為密切。

稻田土壤中甲烷相關(guān)菌的多樣性也受溫度、有機(jī)質(zhì)含量、土壤中電子受體含量等因素影響。任何一個(gè)因素的變化, 都會(huì)導(dǎo)致其他因素發(fā)生變化, 最終會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性變化。例如溫度的變化可以影響所有的生化過程, 包括甲烷相關(guān)菌的代謝以及為產(chǎn)甲烷菌提供底物的微生物的代謝活性; 同時(shí)溫度也會(huì)通過影響土壤的理化性質(zhì)影響甲烷菌。因此這個(gè)過程是復(fù)雜的、交織和變化的。本研究僅從水稻生理角度討論光合產(chǎn)物分配對(duì)稻田甲烷排放及土壤甲烷相關(guān)菌的影響, 闡明通過遺傳修飾改變水稻光合同化物分配可以達(dá)到稻田甲烷減排的預(yù)期, 為今后低甲烷排放水稻品種的培育提供了一個(gè)研究思路。

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Effects of heterogous expression of2 rice on methane mitigation and related micro-organism abundance in paddy fields*

SU Jun, SHAN Zhen, CHEN Zaijie

(Biotechnology Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences / Fujian Provincial Key Laboratory of Genetic Engineering for Agriculture, Fuzhou 350003, China)

A field experiment was conducted to explore the effects of genetically modified rice with2 gene on paddy field methane mitigation.2 gene is a transcription factor that acts on the upstream of starch synthesis pathway and is recognized as a key regulator for barley starch accumulation and assimilation distribution. Previous studies have shown that japonica rice (L. subsp.) integrated with2 gene significantly reduces methane emission in paddy fields and increases content of seed starch. To further understand gene effects on cutting down of methane emissions under different rice genetic conditions, we introduced2 into indica rice (L.subsp.) and then investigated methane emissions from2 rice field as well as the population size of bacteria associated with methane emissions in paddy fields during the growing season from April to September 2016. The results showed that the range of methane mitigation for the whole season was 54.7%–3.8%, compared with the control (wild rice). The highest mitigation rate was during booting period, reaching 54.7%. Total methane emissions of the two lines of2 rice were respectively 5 060.16 mg?m-2and 5 250.60 mg?m-2, while that under wild rice was 7 249.68 mg?m-2for the period from the first measurement to harvest. Methane reduction rates of the two lines were 30.30% and 27.58%, respectively. The abundance of 6 orders or families of methanogens and 2 groups of methanotrophs in2 rice fields showed significant (< 0.05,< 0.01) decreases almost throughout the entire growing season when2 rice was compared with wild rice. In addition, total bacteria populations during rice tillering, heading and flowering periods were significantly (< 0.05,< 0.01) lower in2 rice than in wild rice. Population size of 6 methanogens were in the order of: Methanosaetaceae (Mst) > Archaea (ARC) > methanogens (MET) > Methanomicrobiales (MMb) > Methanosarcinaceae (Msc) > Methanobacteriales (MBT). Among these, Methanosaetaceae had the largest community, followed by Archaea. Of the 2 groups of methanotrophs, the abundance of MBAC was much larger than that of TYPE Ⅱ. After comparison of our experimental data with other studies, we concluded that2 rice mechanism for reducing methane emission more likely regulated carbohydrate flow to ground parts of the plant, reduced assimilates transported to soil and lowered methane-related bacteria abundance, which ultimately reduced methane emissions.

Rice; Heterogous expression of2; Methanon mitigation; Methanogen; Methanotroph; Bacteria abundance

, SU Jun, E-mail: sj@fjage.org

Jan. 23, 2018;

May 15, 2018

10.13930/j.cnki.cjea.180109

Q89; Q78

A

1671-3990(2018)09-1333-10

2018-01-23

2018-05-15

* This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31670416), Fujian Science and Technology Project (2015N0037), Fujian Public Scientific Research Institution Foundation (2018R1019-1) and the Science and Technology Project of Fujian Academy of Agricultural Sciences (A2015-02).

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31670416)、福建省科技項(xiàng)目(2015N0037)、福建省屬公益類項(xiàng)目(2018R1019-1)和福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技項(xiàng)目(A2015-02)資助

蘇軍, 主要從事水稻分子研究。E-mail: sj@fjage.org

蘇軍, 單貞, 陳在杰. 異源表達(dá)2水稻對(duì)稻田甲烷排放及土壤相關(guān)菌群的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 26(9): 1333-1342

SU J, SHAN Z, CHEN Z J. Effects of heterogous expression of2 rice on methane mitigation and related micro-organism abundance in paddy fields[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2018, 26(9): 1333-1342