超聲波促進巴氏醋桿菌發(fā)酵生長的研究

孫 悅，夏 蓉，陶匯源，石吉勇，鄒小波*

（1.江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

食醋是人們?nèi)粘Ｉ畹囊环N重要調(diào)味品，在中國傳統(tǒng)食醋釀造中，鎮(zhèn)江香醋是米醋的典型代表之一，因其具有“酸而不澀，香而微甜，色濃味鮮，愈存愈香”的特點，受到國內(nèi)外消費者的青睞。鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過程中主要分為三個階段：糖化階段、酒精發(fā)酵階段、醋酸發(fā)酵階段[1]。前期研究表明，在固態(tài)發(fā)酵階段，微生物種群相對穩(wěn)定，且微生物種類和微生物活性在發(fā)酵過程中呈周期性變化[2]。醋酸桿菌是香醋發(fā)酵階段微生物中重要的優(yōu)勢產(chǎn)酸菌屬之一，在食醋生產(chǎn)過程中起著關鍵作用。因此，對生產(chǎn)過程中醋酸桿菌的調(diào)控具有重要意義。

近年來，超聲波技術已經(jīng)廣泛應用于食品微生物領域。超聲波是一種頻率高于20 kHz的能量機械波，具有方向性好、穿透能力強、振動強烈等特點[3]。當超聲波穿過液體時，這種機械波產(chǎn)生的高頻振動會導致物料內(nèi)部受到快速劇烈的擠壓膨脹，產(chǎn)生微射流。由超聲產(chǎn)生的微射流會增強細胞的通透性，同時還會加快細胞壁及細胞膜邊界層的傳質(zhì)速率，改變細胞的生理代謝，從而強化發(fā)酵過程[4-5]。SINISTERRA J V[6]研究表明，超聲波可以刺激細胞及酶活，并且可以在細胞邊界層或者通過細胞壁和細胞膜改變細胞的代謝、提高物質(zhì)（物料及產(chǎn)物）傳遞。同時超聲波產(chǎn)生的微射流還可以打散團聚的細胞，提高細胞對營養(yǎng)成分的利用率，增大細胞的生物量。DAI C等[7-8]對超聲刺激阿氏假囊酵母（Ecemothecium ashbyii）發(fā)酵產(chǎn)生核黃素進行研究，結(jié)果表明，在最佳處理條件（超聲頻率24 kHz）下，超聲不僅可以促進菌絲體生長，還可以提高核黃素的產(chǎn)量。DAHROUDA B D等[9]用振幅40%，時間30 s的低強度超聲場處理干酪乳酸桿菌（Lactobacillus caseisubsp.）發(fā)酵液后證實，低強度超聲可以促進乳酸桿菌發(fā)酵，其中L-乳酸產(chǎn)量及生物量均提高了約25%。此外，國內(nèi)外學者進行了超聲強化發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）[10]、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）[4]和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[11-12]的發(fā)酵特性及理化特性研究，均取得了明顯的促進效果。然而，有關香醋發(fā)酵過程中超聲強化巴氏醋桿菌（Acetobacterpasteurianus）發(fā)酵特性的研究鮮見報道。

因此，本研究以巴氏醋桿菌（A.pasteurianus）為研究對象，采用超聲波技術研究超聲波功率、超聲時間及溫度對發(fā)酵過程中巴氏醋酸桿菌的生物量、產(chǎn)酸能力及細胞通透性的影響，為鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過程的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏醋桿菌（A.pasteurianus）CICC 20041：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、酵母提取物、NaCl、瓊脂、NaOH、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH 6.8左右，121℃滅菌15 min，等溫度降至50℃左右時加入無水乙醇3%。

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂2%。

1.2 儀器與設備

BS2000S電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；T6新世紀型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；GHP-9050型隔水式培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；HYL-C小型組合式搖床：太倉市強樂實驗設備有限公司；KS-120AL超聲波設備：深圳市科潔超聲科技有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)

從4℃冰箱中保藏的試管斜面菌種中挑取少量菌種A.pasteurianusCICC 20041，在無菌條件下接種于液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，得到巴氏醋桿菌培養(yǎng)液。然后以1%的接種量接種于盛有200 mL的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速170 r/min條件下培養(yǎng)24 h，得到的巴氏醋桿菌以備后面的試驗。

1.3.2 巴氏醋桿菌生長曲線的測定

巴氏醋桿菌在37℃、170 r/min的發(fā)酵條件下進行發(fā)酵，以未接種菌體的液體培養(yǎng)基作為空白對照，在生長至0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、11 h、24 h、32 h時取發(fā)酵液，在波長600 nm處測定吸光度值。繪制巴氏醋桿菌的生長曲線。

1.3.3 巴氏醋桿菌的超聲波處理條件優(yōu)化單因素試驗

當接種量為1%的醋酸桿菌在200 mL培養(yǎng)基中發(fā)酵至24 h時，取5 mL的發(fā)酵液進行超聲處理，處理后的樣品進行微生物菌落總數(shù)計數(shù)。分別吸取1 mL未經(jīng)處理和經(jīng)過超聲處理的菌懸液，用無菌生理鹽水稀釋到適宜梯度，涂布在固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，得到經(jīng)過超聲處理后的菌落數(shù)為N（CFU/mL），未經(jīng)處理的菌懸液的菌落數(shù)為N0（CFU/mL），以生物量增量（%）來評價超聲波對醋酸桿菌的影響。

采用單因素輪換法，分別選擇超聲時間（5min、10min、15 min、20 min、25 min）、超聲溫度（25 ℃、40℃、55 ℃）、超聲功率（200 W、400 W、600 W、750 W）對培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液進行處理，測定生物量增量以確定最適超聲條件。

其中為防止超聲時間過長熱效應引起的溫度上升，使用冰袋進行及時降溫。

1.3.4 不同生長期超聲處理對巴氏醋桿菌產(chǎn)酸能力的影響

將相同濃度的巴氏醋桿菌種子液按接種量1%分別接種到200 mL培養(yǎng)基中，在37℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)。每隔一段時間（2 h、5 h、8 h、10 h、20 h、25 h、32 h）分別對發(fā)酵液進行超聲處理，超聲處理條件選擇單因素試驗優(yōu)化得到的最佳參數(shù)，處理后繼續(xù)進行搖床發(fā)酵，96 h后測定醋酸桿菌在不同生長時期超聲處理的總酸含量，以未經(jīng)超聲處理發(fā)酵96 h的發(fā)酵液中的總酸含量為對照?？偹釡y定采用標準NaOH溶液滴定法[13]。

1.3.5 超聲處理對巴氏醋桿菌細胞通透性的影響

取3 mL發(fā)酵24 h時的菌液，稀釋5倍，以5 000 r/min的速率離心5 min，取上清液，以未接種菌種的液體培養(yǎng)基為空白，在超聲溫度為單因素確定的最適溫度條件下，測定不同超聲時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）和不同超聲功率（200 W、400 W、600 W、750 W）前后巴氏醋桿菌細胞外液核酸、蛋白質(zhì)的變化，判斷超聲處理對細胞膜通透性的影響。

核酸和蛋白質(zhì)提高率的測定：參考文獻[14]，分別在波長260nm和280 nm條件下，測定菌液的吸光度值。核酸提高率的計算公式如下：

式中：R1為核酸提高率，%；a表示未超聲處理的菌液在波長260 nm處的吸光度值；b表示經(jīng)過超聲處理后的菌液在波長260 nm處的吸光度值。

蛋白質(zhì)的提高率計算公式如下：

式中：R2為蛋白質(zhì)提高率，%；c表示未超聲處理的菌液在波長280 nm處的吸光度值；b表示經(jīng)過超聲處理后的菌液在波長280 nm處吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴氏醋桿菌生長曲線

圖1 巴氏醋桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curve ofA.pasteurianus

巴氏醋桿菌生長曲線如圖1所示。由圖1可知，巴氏醋桿菌的生長遲滯期較短，說明巴氏醋桿菌可以很快適應新的培養(yǎng)基并快速繁殖生長。對數(shù)生長期約為2～15 h，當發(fā)酵時間為24h時，菌株處于穩(wěn)定期，此時期的菌株個體形態(tài)及生理指標都相對較為穩(wěn)定。巴氏醋桿菌的生長曲線符合Logistic模型。

2.2 巴氏醋桿菌的超聲波處理條件優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 超聲時間對巴氏醋桿菌的影響

在超聲波功率為400 W，超聲溫度為40℃的條件下，超聲時間對巴氏醋桿菌生物量的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同超聲時間對巴氏醋桿菌生物量增量的影響Fig.2 Effects of different ultrasound time on the biomass increment ofA.pasteurianus

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，巴氏醋桿菌的生物量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當超聲時間為20 min時，巴氏醋桿菌的生物量增量最高，為41.80%，說明將超聲波作用于巴氏醋桿菌發(fā)酵過程中，在一定條件下可以提高其活菌數(shù)量。分析原因可能是在發(fā)酵過程中施加超聲，超聲波產(chǎn)生的高頻振動將能量傳入細胞內(nèi)部，細胞內(nèi)組織結(jié)構(gòu)受到反復的收縮和舒張作用而產(chǎn)生“海綿效應”，從而可以促進細胞內(nèi)外的物質(zhì)傳遞，加速細胞生理代謝反應的進行，從而提高細菌的生物量[15]；當超聲時間為5 min時，醋酸桿菌生物量增量為-3.47%，與無超聲作用基本相同（P＞0.05），可能是因為超聲作用時間較短，超聲產(chǎn)生的效應不明顯。超聲15min和20min的細胞生物量增量無顯著性差異（P＞0.05），因此選擇最優(yōu)超聲時間為15 min。HUANG G等[16]對超聲如何提高熱帶念珠菌（Candida tropicalis）細胞膜的通透性及生長速率進行了研究，也發(fā)現(xiàn)短時間的超聲提高生物量的效果較好，長時間的超聲會抑制細菌的生長。本試驗與其所得結(jié)論一致。

2.2.2 超聲溫度對巴氏醋桿菌的影響

在超聲波功率為400 W，超聲時間為15 min的條件下，超聲溫度對巴氏醋桿菌生物量的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同超聲溫度對巴氏醋桿菌生物量增量的影響Fig.3 Effects of different ultrasound temperature on the biomass increment ofA.pasteurianus

由圖3可知，隨著超聲溫度的升高，巴氏醋桿菌的生物量增量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當超聲溫度為25℃時，巴氏醋桿菌的生物量增量為-18.15%；當超聲溫度為40℃時，巴氏醋桿菌的生物量增量為31.37%；但當超聲溫度為55℃時，巴氏醋桿菌的生物量增量僅為-99.88%，說明超聲溫度對醋酸桿菌的生物量具有影響，尤其是較高溫度下的影響更顯著（P＜0.05）。朱瑤迪等[17]研究表明，在高溫下施加超聲會增強超聲對醋酸桿菌的致死效果，從而不利于發(fā)酵的進行。EVELYN E等[18]研究超聲對脫脂牛奶和牛肉中嗜冷芽孢桿菌（Bacillus psychrophilus）的致死效應，發(fā)現(xiàn)在較高溫度下施加超聲可以增強對細菌的致死率。本試驗與其研究結(jié)果一致。因此選擇最優(yōu)超聲溫度為40℃。

2.2.3 超聲功率對巴氏醋桿菌的影響

在超聲時間為15min，超聲溫度為40℃的條件下，超聲波功率對巴氏醋桿菌生物量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同超聲功率對巴氏醋桿菌生物量增量的影響Fig.4 Effects of different ultrasound power on the biomass increment ofA.pasteurianus

由圖4可知，隨著超聲波功率的增大，巴氏醋桿菌細胞生物量增量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。其中在較低功率和較高功率條件下，施加超聲對醋酸桿菌均有輕微抑制作用。分析原因可能是超聲功率太小時，不能有效夠刺激細胞內(nèi)和細胞外物質(zhì)傳遞及能量交換[12]，而超聲功率過大會導致其空化效應顯著，由超聲產(chǎn)生的高頻振動使得介質(zhì)中的液體發(fā)生快速膨脹和收縮，在介質(zhì)中產(chǎn)生空泡，超聲產(chǎn)生的破壞應力（剪切力）會使空泡產(chǎn)生瞬間爆破，從而形成強大的動能和壓縮能[3，19]，破壞細胞的完整性。另外高功率超聲還會使水分子裂解產(chǎn)生少量具有強氧化能力的自由基，破壞細胞活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，加速細胞死亡[20]。當超聲功率為600W時，巴氏醋桿菌生物量相比無超聲作用增加了82.35%，表明合適功率的超聲波對巴氏醋桿菌具有一定刺激作用。YANG F等[21-22]研究表明，超聲的聲孔效應會使微生物細胞膜上暫時產(chǎn)生微小孔洞，從而為基本營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞及有毒有害物質(zhì)的去除提供通道，提高細胞膜的滲透性。

2.3 不同生長期超聲處理對巴氏醋桿菌產(chǎn)酸能力的影響

分別在巴氏醋桿菌發(fā)酵2 h、5 h、8 h、10 h、20 h、25 h和32h時，進行超聲處理。巴氏醋桿菌不同生長時期進行超聲處理對其總酸含量的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同生長時期超聲處理對巴氏醋桿菌總酸含量的影響Fig.5 Effects of ultrasound treatment on total acid content of A.pasteurianusat different fermentation periods

由圖5可知，與對照組總酸含量（21.00 g/L）相比，在巴氏醋桿菌發(fā)酵2 h、10 h、20 h、25 h時進行超聲處理，均會增加總酸含量，其中在平穩(wěn)期中期（25 h）總酸含量最多為24.50 g/L，提高率為16.70%。這可能是由于巴氏醋桿菌在發(fā)酵對數(shù)期中期細胞中酶活較強，導致超聲刺激對其影響不顯著（P＞0.05）[12]。而隨著發(fā)酵的進行，進入平穩(wěn)期后，超聲的微流擾動可以將團聚的細胞分散開，使得培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)得到充分利用，從而加快物質(zhì)的傳遞與合成速率[15]；同時，超聲會使酶的活性發(fā)生改變，酶與底物碰撞機率增大，細胞的生理代謝速率增強[22-24]，從而促進醋酸分子的合成。

2.4 超聲處理對巴氏醋桿菌細胞通透性的影響

不同超聲時間和超聲功率對巴氏醋桿菌細胞通透性的影響結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同超聲時間（a）和超聲功率（b）對巴氏醋桿菌細胞通透性的影響Fig.6 Effects of different ultrasound time(a)and ultrasound power(b)on cell permeability ofA.pasteurianus

由圖6（a）可知，隨著超聲時間的增加，細胞外核酸和蛋白質(zhì)的滲出濃度提高率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，且核酸和蛋白質(zhì)的提高率基本相同。當超聲時間為5 min時，巴氏醋桿菌細胞外液中核酸與蛋白質(zhì)的提高率最高，分別為4.17%和3.93%，其原因可能是由于在超聲時間為5 min時，超聲的空化效應和機械效應使得細胞受到瞬時的動能和壓縮能，造成表面微傷，使細胞壁局部破裂，從而改變細胞膜的通透性，加速細胞內(nèi)外核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的交換速率；當超聲時間為10 min時，細胞通透性逐漸恢復到原來的水平，這可能是由于當超聲條件適宜時，超聲造成的細胞表面?zhèn)谳^小，能夠被醋酸桿菌自身修復，從而抑制核酸和蛋白質(zhì)的滲出[14]；但隨著超聲時間的再次增大至15～25 min時，胞外核酸和蛋白質(zhì)的滲出濃度提高率再次升高，這可能是因為超聲對細胞膜的通透性影響逐漸超過了菌體的承受能力[14]。因此選擇最優(yōu)超聲時間為15 min。

由圖6（b）還知，當超聲功率≤600 W時，核酸和蛋白質(zhì)提高率較小，表明超聲功率較小時對細胞的通透性影響不大；然而隨著超聲功率增大至750 W時，核酸和蛋白質(zhì)的提高率分別升高至24.6%和28.3%，分析原因可能是當施加較大超聲功率時，巴氏醋桿菌細胞膜的通透性受到顯著影響（P＜0.05），細胞開始崩解，導致細胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)大量滲出。因此，考慮細胞通透性和生物量，選擇600W為最優(yōu)超聲功率。

3 結(jié)論

本試驗研究了超聲波對巴氏醋桿菌生物量、代謝產(chǎn)物及細胞通透性的影響，結(jié)果表明，最優(yōu)超聲條件為超聲時間15 min、超聲溫度40℃、超聲功率600 W。在此最優(yōu)超聲條件下，與無超聲處理相比，巴氏醋桿菌生物量增加82.35%。通過對巴氏醋桿菌不同生長時期進行超聲處理，得出在穩(wěn)定期中期（25 h）進行超聲處理時，對巴氏醋桿菌的總酸含量影響顯著（P＜0.05），總酸含量提高了16.7%，表明在合適的生長期進行超聲處理有利于發(fā)酵的進行。超聲處理對巴氏醋桿菌細胞外液核酸及蛋白質(zhì)滲透性的影響結(jié)果顯示，核酸和蛋白質(zhì)的提高率均隨著超聲時間和超聲功率的增大呈先降低后升高的趨勢。將超聲波處理技術應用于巴氏醋桿菌發(fā)酵過程中生長特性及代謝產(chǎn)物的研究，對調(diào)控香醋發(fā)酵、提高產(chǎn)品品質(zhì)具有一定理論指導和實踐價值。