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      在慢阻肺炎癥反應(yīng)中黃芪多糖的抗炎作用及 抑制TLR4/NF-κB通路的機(jī)制

      2018-09-07 10:28:30堯雪洲
      關(guān)鍵詞:單核細(xì)胞源性炎癥

      吳 佳,堯雪洲

      (1. 長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410004;2. 云南中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心,云南昆明 650500)

      慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)屬于慢性呼吸系統(tǒng)疾病[1-2],臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性氣流受限。近年研究顯示,我國(guó)COPD的發(fā)病率與死亡率逐年升高,每年引發(fā)百萬(wàn)人死亡[3-4]。COPD的本質(zhì)是肺部的慢性炎癥反應(yīng),主要病理表現(xiàn)是慢性支氣管炎與肺氣腫[5]。目前,COPD的治療藥物主要是糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)、抗生素、β2受體激動(dòng)劑等,主要作用是緩解急性期癥狀,長(zhǎng)期使用后部分患者會(huì)出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素抵抗[6],仍缺乏能有效治療肺部炎癥反應(yīng)的藥物。研究表明,Toll樣受體(TLR)存在于人體內(nèi)多種炎癥細(xì)胞表面,參與天然免疫和獲得性免疫,與氣道的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[7]。其中TLR4可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,啟動(dòng)炎性IL-1β的表達(dá),引起炎性細(xì)胞的活化和炎性介質(zhì)的釋放,促進(jìn)炎癥因子的分泌[8]。肺泡巨噬細(xì)胞(AM)由單核細(xì)胞分化,在肺臟發(fā)揮吞噬、免疫和分泌的作用。正常情況下,AM具有抑炎作用, 當(dāng)組織損傷時(shí),AM可以起到促炎作用以維持組織穩(wěn)態(tài)[9],外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞是AM研究的可替代模型[10]。黃芪多糖(APS)是一種具有生物活性的水溶性多糖,從中藥黃芪的根莖中提取,參與體細(xì)胞免疫,具有增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞活性及抑制細(xì)胞分泌炎癥因子的作用[11-12],減少組織細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)COPD患者的外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞,觀察不同濃度的APS對(duì)巨噬細(xì)胞中TLR4/NF-κB通路的影響,闡述其與慢性炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1主要儀器及試劑酶標(biāo)儀(奧地利Anthosht公司),超凈工作臺(tái)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司),Medisoft Hypair M prov02(比利時(shí)麥迪公司),高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司),肺功能測(cè)定儀(日本Chest),CO2培育箱(Heraeus公司),APS(惠州市東方植物保健科技有限公司),SH30809.01 RPMI 1640培養(yǎng)液(Hyclone),胎牛血清(Life Technology公司),藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD14單克隆抗體(法國(guó)Immunotech公司),總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(深圳?;锟萍脊?,基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9, MMP-9)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、白介素-6(interleukin- 6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海滬尚)。

      1.2資料來(lái)源根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2017年修訂版) 診斷標(biāo)準(zhǔn)[13],選擇2017年3月-6月在長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院校企合作醫(yī)院呼吸科門診就診的COPD穩(wěn)定期男性患者19例,年齡(60.7±8.3)歲;另外選取同期體檢男性健康志愿者20例,年齡(59.3±8.4)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):非器官功能性障礙、腫瘤及精神疾病患者。所有對(duì)象均無(wú)過(guò)敏史、近2周內(nèi)無(wú)上呼吸道感染史。研究方案經(jīng)所在醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),所有受試者自愿加入并簽署知情同意書。

      1.3肺功能檢測(cè)使用肺功能重復(fù)3次測(cè)量?jī)x測(cè)量受試者的第1秒用力呼氣容積(FEV1)和用力肺活量(FVC),獲得平均值并計(jì)算FEV1/FVC和FEV1下降程度(占預(yù)計(jì)值%)。

      1.4外周血中單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定清晨抽取受試者外周靜脈血4 mL置于抗凝管內(nèi),F(xiàn)icoll梯度離心法獲得單核細(xì)胞(PBMC)[14],調(diào)整密度為2×106/mL后加入RPMI 1640培養(yǎng)液并接種在6孔板中,37 ℃與50 mL/L CO2環(huán)境下培養(yǎng)2 h,待細(xì)胞貼壁后,在每孔中加入10 ng/mL rhGM-CSF完全培養(yǎng)基,共培養(yǎng)6 d。在第1天和第6天,使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期非處理單核細(xì)胞,PBS洗滌3次,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,采用PE標(biāo)記的CD14抗體,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)5組細(xì)胞表面分化抗原CD14的表達(dá)情況,并計(jì)算陽(yáng)性率[15]。

      1.5實(shí)驗(yàn)分組將分離培養(yǎng)的COPD患者外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞進(jìn)行分組。LPS組:在培養(yǎng)基中加入5 μg/mL LPS[16];APS高濃度組:同時(shí)加入APS(200 μg/mL)和LPS(5 μg/mL);APS低濃度組:同時(shí)加入LPS(5 μg/mL)和APS(50 μg/mL)共同干預(yù)24 h;COPD組及健康對(duì)照組:不用藥物在原有環(huán)境下培養(yǎng)24 h。各組干預(yù)后收集細(xì)胞及上清液分別用于TLR4/NF-κB通路和炎癥因子指標(biāo)檢測(cè)。

      1.6ELISA法測(cè)定IL-6、MMP-9、TNF-α、PGE2含量提前1 d將―80 ℃凍存的各組細(xì)胞上清液置于4 ℃,實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從4 ℃冰箱中取出,將IL-6、MMP-9、TNF-α、PGE2試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞上清液置于室溫中平衡20 min,根據(jù)說(shuō)明書的操作步驟檢測(cè)各個(gè)待測(cè)指標(biāo)A值,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得樣品中各炎癥因子的含量。

      1.7熒光定量PCR檢測(cè)TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)按照Trizol試劑說(shuō)明書要求提取單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞內(nèi)總RNA并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。所有引物(表1)均由杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公司合成。結(jié)果采用2-△△Ct相對(duì)定量分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

      表1引物序列

      Tab.1 Primer sequences

      基因引物序列(5'-3')TLR4F-ATAAGTGTCGAACTCCCTCR-GCTCATTCCTTACCCAGTNF-κBF-TGCACCTAGCTGCCAAAGAAR-TCTGCTCCTGCTGCTTTGAGAGAPDHF-AATGCATCCTGCCACCACCAACTGCR-GGAGGCCATGTAGTAGGCCATGAGGTC

      2 結(jié) 果

      2.1肺功能檢測(cè)結(jié)果與健康志愿者比較,COPD患者FEV1/FVC與FEV1占預(yù)計(jì)值百分比均明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

      表2兩組研究對(duì)象肺功能的比較

      與健康對(duì)照組比較,*P<0.05。

      2.2單核細(xì)胞分化、分離及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)1 d,COPD組部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁,細(xì)胞體積仍然較小,培養(yǎng)到第6天時(shí),細(xì)胞貼壁牢固,體積明顯增大,最大的細(xì)胞直徑可達(dá)40 μm,細(xì)胞形狀從不規(guī)則形逐漸變成橢圓形,少數(shù)細(xì)胞為長(zhǎng)梭形(圖1)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(圖2)顯示,培養(yǎng)1 d細(xì)胞表面CD14陽(yáng)性率為(2.35±1.8)%,培養(yǎng)6 d的CD14陽(yáng)性細(xì)胞為(8.2±3.2)%。提示單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。

      圖1倒置相差顯微鏡下COPD組單核細(xì)胞(A)與單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞(B)

      Fig.1 The inverted microscope imaging of mononuclear cells (A) and monocyte-derived macrophages (B) in COPD group (×200)

      圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)COPD組單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)1d及6d的CD14表達(dá)情況

      Fig.2 CD14 expression of 1 d and 6 d in cultured monocyte-derived macrophage cell (detected by flow cytometry) in COPD group

      2.3ELISA法檢測(cè)炎癥因子的含量及比較與健康對(duì)照組比較,COPD組中炎癥因子(IL-6、MMP-9、TNF-α、PGE2)含量明顯升高(P<0.05);LPS組4個(gè)炎癥因子的含量均高于COPD組(P<0.05);與LPS組比較,APS組中炎癥因子含量明顯下調(diào)(P<0.05),而且APS高濃度組下調(diào)幅度更大(P<0.05,表3)。

      表3各組炎癥因子含量的比較

      Tab.3 Comparison of the contents of inflammatory factors in each group

      組別TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)MMP-9(ng/mL)PGE2(ng/mL)COPD組104.97±1.46*46.22±0.64*4.83±0.41*18.42±0.43*健康對(duì)照組0.41±0.08#25.10±0.64#1.71±0.23#7.72±0.3#LPS組219.63±1.30*#217.41±0.94*#17.88±0.19*#74.18±0.35*#APS高濃度組117.40±0.65△37.48±0.61△8.97±0.37△36.73±0.71△APS低濃度組166.59±1.11△151.61±0.97△14.35±0.54△58.46±1.02△

      與健康對(duì)照組比較,*P<0.05;與COPD組比較,#P<0.05;與LPS組比較,△P<0.05。

      2.4熒光定量PCR檢測(cè)各組中TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)與健康對(duì)照組比較,COPD組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)增加(P<0.05);與COPD組相比,LPS組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)升高(P<0.05);APS組中TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)比LPS組顯著下降(P<0.01),且高濃度組下降更明顯(P<0.05,表4)。

      表4熒光定量PCR檢測(cè)各組中TLR4、NF-κBmRNA的表達(dá)

      Tab.4 q-PCR detection of TLR4 and NF-κB mRNA expressions in each group

      組別TLR4NF-κBCOPD組1.72±0.18*2.07±1.31*健康對(duì)照組0.24±0.02#0.41±0.08#LPS組4.18±2.34*#3.93±2.51*#APS高濃度組1.95±0.81△2.33±0.75△APS低濃度組3.77±0.43△3.60±0.24△

      與健康對(duì)照組比較,*P<0.05;與COPD組比較,#P<0.05;與LPS組比較,△P<0.05。

      3 討 論

      COPD患者的氣道和肺實(shí)質(zhì)存在多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)類型與疾病嚴(yán)重程度有關(guān),TLR4參與COPD的病理過(guò)程和免疫應(yīng)答[17-18]。NF-κB是TLR4信號(hào)下游重要的核轉(zhuǎn)錄激活因子,TLR4與配體結(jié)合后引發(fā)多種下游效應(yīng)[19-20],活化NF-κB并促進(jìn)白介素等炎癥因子的分泌,使粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生趨化聚集效應(yīng),導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)。LPS存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁中,可以導(dǎo)致炎癥反應(yīng),在肺能引起炎癥細(xì)胞積聚,以中性粒細(xì)胞為主,其結(jié)合TLR4可促使p38MAPK、NF-κB等分子活化而誘導(dǎo)MMP-9的過(guò)度表達(dá)[21],并分泌TNF-α、MCP-1、IL-6等。與既往研究結(jié)果相同的是,本研究COPD組細(xì)胞中炎癥因子的含量均高于健康對(duì)照組,說(shuō)明在肺部炎癥反應(yīng)中,巨噬細(xì)胞有參與其中,LPS可以通過(guò)激活平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[22]。LPS刺激后,巨噬細(xì)胞中的TLR4、NF-κB的mRNA和炎癥因子IL-6、TNF-α、PGE2均明顯增加,提示LPS刺激通過(guò)TLR4/NF-κB通路釋放大量炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子,加重炎癥反應(yīng)。

      《中國(guó)藥典》2015年版記載黃芪是一味具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫等功效的常用中藥,是臨床中重用的補(bǔ)氣藥之一。黃芪被廣泛用于高血壓、糖尿病、腎病綜合征等疾病的臨床治療。COPD屬于中醫(yī)咳嗽、痰飲、喘癥的繼發(fā)之病[23],外邪入侵和內(nèi)傷襲肺是中醫(yī)理論中肺病的主要病機(jī),肺主呼吸,朝百脈,匯聚氣血。氣虛、血淤是引發(fā)肺病的重要病理基礎(chǔ),肺氣虧虛是病機(jī)之本。APS是黃芪中的主要成分之一,近年來(lái)受到越來(lái)越多的研究者關(guān)注,被應(yīng)用于肝纖維化、糖尿病、抗氧化等方面的研究[24-27],但少見(jiàn)有關(guān)APS用于治療肺部疾病的研究報(bào)道。本研究應(yīng)用APS與LPS共同刺激COPD患者外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞,結(jié)果顯示APS干預(yù)后減輕了LPS刺激細(xì)胞內(nèi)TNF-α、PGE2表達(dá),并且APS高劑量組效果最為明顯,提示APS對(duì)COPD患者的巨噬細(xì)胞具有保護(hù)作用,起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族,水解后可降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)和組織連接蛋白的活性[28]引起氣道的炎癥反應(yīng)。NF-κB可以調(diào)控MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平,細(xì)胞未受刺激時(shí),NF-κB的抑制蛋白IκBα處于穩(wěn)定狀態(tài),細(xì)胞遇到刺激后,IκBα被降解,NF-κB被激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控MMP-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[29],本研究結(jié)果顯示,APS對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用,MMP-9含量隨APS濃度增加而降低,提示APS可以通過(guò)TLR4/NF-κB通路抑制MMP-9的生成,抑制ECM的降解,使肺泡壁間隔增厚減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,起到保護(hù)血管壁防止血管過(guò)度擴(kuò)張,防止纖維化形成的作用,從而改善患者肺功能。TNF-α是一種參與全身炎癥反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)蛋白,僅在血液中存在,廣泛存在于包括神經(jīng)組織在內(nèi)的多種組織中。TNF-α可引起肺組織內(nèi)溶酶體受損[30],損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞,NF-κB通過(guò)上調(diào)細(xì)胞環(huán)氧化酶2的活性和表達(dá)[31],引起炎癥因子PGE2的合成增加,促進(jìn)炎性反應(yīng)。本研究表明APS處理可以降低TNF-α、PGE2水平,推測(cè)APS可能對(duì)肺泡細(xì)胞起到修復(fù)作用,改善血管內(nèi)皮功能。

      目前,對(duì)肺損傷疾病的中藥治療藥物的研究正成為藥理學(xué)的研究熱點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了APS在COPD炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制,APS可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)而發(fā)揮抗炎作用,促進(jìn)肺組織的修復(fù)。

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