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      針灸對實驗性糖尿病小鼠心臟功能調(diào)節(jié)的影響

      2018-09-07 10:28:30鄭曉燕唐純志
      關鍵詞:內(nèi)徑心動圖艾灸

      鄭曉燕,唐純志

      (廣州中醫(yī)藥大學,廣東廣州 510006)

      糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM),是由糖尿病引發(fā)的一種廣泛性局灶性心肌壞死,具有病情發(fā)展快、致死率高的特點。心血管并發(fā)癥是1型糖尿病患者發(fā)病和死亡的主要原因[1],其中DCM是糖尿病患者引起心衰的主要原因,主要表現(xiàn)為心肌收縮功能下降[2]。目前,國內(nèi)外針對DCM尚無有效的治療方法,對其復雜的病理生理機制探討甚少。針灸療法是中醫(yī)治法中一個重要組成部分。文獻報道針灸治療糖尿病及其并發(fā)癥具有整體調(diào)節(jié)、降低血糖的作用。肖鳳英等[3]采用超聲心動圖評價電針內(nèi)關穴治療DCM,提示電針內(nèi)關穴明顯改善大鼠心功能;祝恩智等[4]報道電針肢體腧穴可減輕2型糖尿病大鼠心臟自主神經(jīng)纖維損害程度;曹少鳴等[5]將42例非胰島素依賴型糖尿病患者隨機分為針刺組、艾灸組、針刺加艾灸組進行比較研究,結(jié)果表明針加灸組的療效最佳;另有研究表明,電針足三里或艾灸足三里可以降低糖尿病大鼠血糖水平[6-7]。但關于電針或艾灸足三里對糖尿病小鼠心肌病的影響鮮見報道。本研究擬通過建立實驗性糖尿病小鼠模型,利用超聲心動圖在體監(jiān)測,探討電針及艾灸對糖尿病小鼠心臟功能的影響。

      1 材料與方法

      1.1實驗動物及分組8~9周齡的雄性C57BL6/J小鼠,購自廣州中醫(yī)藥大學動物中心(合格證批號:44007200041981),飼養(yǎng)于室溫(24±1)℃、相對濕度(45±5)%、日光燈照射12 h明暗交替的標準動物實驗室,自由飲水。適應性喂養(yǎng)72 h后按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、糖尿病組、電針干預組、艾灸干預組,每組12只。實驗過程中對動物的處理均符合科技部頒布的“關于善待實驗動物的指導性意見”。

      1.2主要試劑和儀器鏈脲佐菌素(STZ, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO);小動物超聲40 MHz傳感器Vevo 2100系統(tǒng)(VisualSonics, Toronto, Canada);Master-8可編程刺激器(以色列/AMPI);針灸針(EL452, Biopac Systems, Goleta, CA);動物實驗用艾灸;血糖檢測試紙試劑盒(愛科來arkray)、京都血糖儀GT19(20型);瑞沃德麻醉機;轉(zhuǎn)棒(滾筒/疲勞)實驗分析系統(tǒng)(上海吉量科技)。

      1.3造模方法以70只雄性8~9周齡的雄性C57BL6/J小鼠為研究對象,隨機抽取12只為空白組,其余以大劑量STZ腹腔注射制備1型糖尿病小鼠模型。腹腔注射STZ 3周后,使用血糖檢測試劑盒測量空腹血糖>11.1 mmoL/L時,1型糖尿病模型成功[8]。成模小鼠38只隨機分為糖尿病組、電針干預組、艾灸干預組,每組12~14只。STZ溶解于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH 4.5),劑量為50 mg/kg[9]??瞻讓φ战M注射等效體積的檸檬酸鹽緩沖溶液。動物在STZ給藥前禁食過夜12 h。給藥后自由用水和食物。

      1.4各組的處理方法參照文獻[10]穴位定位,足三里ST36穴位位于小鼠脛骨前肌脛骨前結(jié)節(jié)外側(cè)2 mm,膝關節(jié)下端4 mm。

      電針干預組:電針時用瑞沃德麻醉機氣麻。電針參數(shù)參考文獻[11],選用12 mm針灸針在足三里穴進針深度約3 mm,用master8電針儀電刺,進行連續(xù)模式刺激15 min,電位差為4 V,電流為40 mA,脈沖寬度為50 μs。兩電極加于兩側(cè)下肢足三里穴。每日1次,每周治療5 d,共8周。

      艾灸干預組:艾灸時使用氣體麻醉。取雙側(cè)“足三里”,采用動物實驗專用細艾條點燃后在穴位處施灸,距離穴位表面2~2.5 cm,用表面溫度計測量,穴位體表溫度40~46 ℃。每次各灸15 min。每周治療5 d,共8周。

      空白對照組與糖尿病組常規(guī)飼養(yǎng)。

      1.5觀察指標及檢測方法小鼠超聲心動圖的檢查:各組治療8周后檢測超聲心動圖。根據(jù)美國超聲心動圖協(xié)會的檢測方法[12],分別對各組小鼠行超聲心動圖B-Mode及M-mode檢測。以15~20 mL/L異氟醚吸入劑與1 L/min 100 mL/L O2混合,麻醉小鼠,以維持整個手術中的輕度鎮(zhèn)靜水平。將小鼠固定在加熱平臺腹側(cè),保持體溫在(37±0.5)℃。ECG電極連續(xù)監(jiān)測心率(HR)和呼吸生理。將小鼠胸部剃光并加熱,將超聲波凝膠應用于感興趣的區(qū)域。使用Vevo 2100系統(tǒng)進行胸腔超聲心動圖檢測。從左心室短軸方向在M型視角下測量左心室LV前壁(LVAW)、LV后壁(LVPW)和LV內(nèi)徑(LVID)的厚度。M型短軸視圖測量的LV結(jié)構(gòu)參數(shù)用于計算LV分數(shù)縮短(FS)。整個實驗過程由經(jīng)過專業(yè)培訓的固定人員按照標準操作規(guī)程實施。

      滾軸實驗:參照文獻[13]的方法,在造模后11周測量小鼠在棒上的步行時間,觀察小鼠的運動和肌肉協(xié)調(diào)能力。訓練階段小鼠在以4 r/min旋轉(zhuǎn)速度在水平棒上行走。訓練階段持續(xù)了3 d,每天3次,每次5 min。在第4天,旋轉(zhuǎn)速率以每40秒增加4 r/min的加速度,直到達到40 r/min的最大速度。記錄各組動物墜落潛伏期,觀察小鼠運動情況。

      1.6統(tǒng)計學分析應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。組間差異比較采用單因素方差分析,繼以LSD-t檢驗比較兩兩之間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結(jié) 果

      2.1一般狀態(tài)觀察實驗過程中,空白組小鼠精神狀態(tài)良好,反應靈敏,動作自如,毛發(fā)平伏有光澤,無死亡。糖尿病組小鼠腹腔注射STZ 3周后開始逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀,精神萎靡、少動、易驚、反應遲鈍、動作遲緩,病程中死亡率達15%,3只小鼠出現(xiàn)腳趾皮膚皮損,飼養(yǎng)的鼠籠墊料有紅色腥臭分泌物。電針干預組精神狀態(tài)稍差,毛色無光澤較正常組差,但比糖尿病組好,大便量較正常組偏多,無死亡。艾灸干預組小鼠性情比較急躁,出現(xiàn)籠間打架的現(xiàn)象,無死亡。

      小鼠糖尿病造模成功后,空腹血糖均在11 mmoL/L以上,表1為電針和艾灸治療前后空腹體質(zhì)量和血糖濃度的比較。與空白組相比,糖尿病組空腹體質(zhì)量下降、血糖濃度明顯升高(P<0.05),而電針干預組和艾灸干預組空腹體質(zhì)量和血糖濃度無明顯變化(P>0.05)。說明針灸對糖尿病小鼠的體質(zhì)量具有較好的調(diào)整作用,電針和艾灸干預可以改善STZ所引起的體質(zhì)量降低。

      表1各組小鼠治療前后空腹體質(zhì)量和血糖比較

      Tab.1 Comparison of fasting weight and glucose level in mice of each group

      組別治療前例數(shù)體質(zhì)量(g)血糖(mmoL/L)治療后例數(shù)體質(zhì)量(g)血糖(mmoL/L)空白組1226±1.57.56±1.501229±3.28.37±1.88糖尿病組1425±1.320.23±1.301219±4.8*25.93±1.60*電針干預組1224±1.821.73±2.191221±8.114.34±1.39艾灸干預組1225±1.319.28±1.231222±7.416.98±1.70

      與空白組比較,*P<0.05。

      2.2各組小鼠超聲心動圖左心室收縮功能的比較4組小鼠均取得清晰的左室短軸切面M型視圖,在此切面上可以看出糖尿病M型曲線收縮期內(nèi)徑增大(圖1A)。圖1B為4組小鼠左室短軸切面M型視圖收縮期左心室內(nèi)徑(LVIDs)。4組小鼠在第11周末彩色超聲心動圖短軸收縮期的內(nèi)徑顯著不同,糖尿病組收縮期內(nèi)徑顯著高于空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而電針干預組和艾灸干預組內(nèi)徑與空白組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。圖1C所示為M型超聲心動圖檢測小鼠左心室收縮功能指標左室短軸縮短率[LVFS=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100%]。4組小鼠在第11周末彩色超聲心動圖短軸縮短率不同,糖尿病組短軸縮短率顯著低于空白組,有統(tǒng)計學差異(P<0.05),而電針干預組和艾灸干預組短軸縮短率與空白組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。進一步分析表明,4組小鼠分別于造模8周后行超聲心動圖檢查,注射STZ 11周后小鼠左心室收縮末期內(nèi)徑增大,左心室短軸縮短率降。糖尿病組與空白組比較提示,糖尿病小鼠在造模8周后出現(xiàn)左心室收縮功能障礙。經(jīng)電針和艾灸治療后,左心室收縮末期內(nèi)徑和左心室短軸縮短率均無差異,說明電針和艾灸均能改善由STZ所誘導的實驗性小鼠心臟收縮功能障礙,兩種干預手段的治療效果相當。

      2.3滾軸實驗結(jié)果利用滾軸實驗測量小鼠11周末的運動體力與肌肉協(xié)調(diào)能力,結(jié)果顯示,糖尿病組的小鼠墜落潛伏期比空白組短,有統(tǒng)計學差異(P<0.05),提示糖尿病小鼠在后期可能會出現(xiàn)運動不協(xié)調(diào)與運動耐力下降。電針干預組墜落潛伏期和艾灸干預組墜落潛伏期與空白組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05,圖2)。

      3 討 論

      中醫(yī)對糖尿病的認識及針灸治則思路,從經(jīng)絡的循行、生理、病理及穴位的選取等方面來講,使用頻次較高的穴位依次是足三里、三陰交、脾俞、肺俞、腎俞[14]。糖尿病心肌病在古代中醫(yī)古籍中的記載多被認為是消渴病的并發(fā)癥,并有其詳細的穴位外治法?!夺樉募滓医?jīng)·五氣溢發(fā)消渴黃癉 第六》云:“消渴身熱,面目赤黃,意舍主之;消渴嗜飲,承漿主之;嗜臥,四肢不欲動搖,腕骨主之;消瘴善,氣走喉咽而不能言,大便難,唾血,口中熱,唾如膠,太溪主之;陰氣不足,熱中,消谷善饑……足三里主之”。

      本實驗小鼠經(jīng)腹腔一次性注射STZ,第3周空腹尾血糖>11.1 mmoL/L為造模成功,模型成功率65%。STZ注射后11周經(jīng)彩色超聲心動圖檢測,與空白組相比,糖尿病組小鼠左心室短軸縮短率明顯下降,出現(xiàn)左心室收縮功能障礙。從國內(nèi)外學者文獻報道中得知,糖尿病心肌超微結(jié)構(gòu)的病變始于4~6周左右[9-10]。本研究在第11周檢測出糖尿病小鼠左心室收縮功能障礙,與上述文獻相符合。

      圖1各組小鼠超聲心動圖左心室收縮功能的比較

      Fig.1 Comparison of left ventricular systolic function in echocardiography of mice in each group

      A:超聲心動圖M型界面下心臟左心室短軸左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)收縮末期內(nèi)徑(LVIDs);B:4組小鼠超聲心動圖M型界面下左心室短軸收縮末期的內(nèi)徑(LVIDs);C:M型超聲心動圖檢測小鼠左心室收縮功能指標左室短軸縮短率(FS%),n=12。*P<0.05。

      圖2四組小鼠滾軸實驗墜落潛伏期差值的比較

      Fig.2 Comparison of the difference between the fall latency in the experiment of four groups of mice

      *P<0.05。

      HAMBLIN等[15]在STZ誘導的糖尿病大鼠中也觀察到8周后心臟收縮功能出現(xiàn)障礙。經(jīng)電針和艾灸治療8周,與空白組相比較,電針干預組和艾灸干預組的左心室短軸縮短率無統(tǒng)計學差異,提示電針及艾灸可能改善了糖尿病小鼠心臟收縮功能障礙。STZ注射后8周,與空白組相比,糖尿病組小鼠滾軸實驗墜落潛伏期明顯下降,運動能力變差。而電針和艾灸治療后小鼠墜落潛伏期與空白組無明顯差異,提示電針和艾灸可能改善由STZ所誘導的運動能力變差。

      近年來,對針灸治療糖尿病的機制研究有了一定的進展,但隨著現(xiàn)代醫(yī)學對糖尿病研究的深入,又提出了新的機制。DA等[16]認為,糖尿病性心肌病與1型糖尿病(T1DM)患者的心臟重塑、心肌功能障礙、低度炎癥和心臟脂聯(lián)素水平降低有關。另外,NIEMANN等[17]發(fā)現(xiàn),糖尿病、肥胖、吸煙和過度污染是發(fā)生心臟疾病的危險因素。糖尿病或肥胖患者心臟疾病的發(fā)病率更高,即使是最佳的藥物治療,心臟線粒體和其他來源的活性氧(ROS)釋放增加也可能導致心功能不全。本研究提示電針或艾灸足三里穴均可以改善實驗性糖尿病小鼠的心功能,但兩者的治療效果相當。推測當心肌處于收縮功能下降狀態(tài)時,電針小鼠雙側(cè)陽明經(jīng)穴區(qū)在提高心臟收縮性能時可能改善了相關經(jīng)穴穴區(qū)的能量代謝和氣血功能活動。電針足三里極有可能是通過改善心肌的線粒體功能來提高心肌的收縮功能。

      綜上所述,由STZ所誘導的心臟收縮功能障礙,電針和艾灸干預治療后心功能和運動功能存在一定的特征性變化。在心肌高糖損傷狀態(tài)下,左心室短軸縮短率顯著降低,電針或艾灸治療后,左心室短軸縮短率顯著升高;而在運動功能方面,心肌高糖狀態(tài)下,滾軸實驗墜落潛伏期較空白組明顯下降,在注射STZ后11周,小鼠出現(xiàn)運動不協(xié)調(diào)性現(xiàn)象,實驗性糖尿病模型心功能可能與運動功能有一定的特異性聯(lián)系,其相關機制需進一步探討。

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