王方珍 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

豬丹毒桿菌是一個(gè)可寄存于哺乳類(lèi)動(dòng)物，家禽和魚(yú)群的歷史悠久的病原，更甚于感染至人類(lèi)。豬丹毒桿菌發(fā)生感染可導(dǎo)致豬急性或者亞急性敗血癥、皮膚壞死、心內(nèi)膜炎等惡疾。近年來(lái)，我國(guó)及亞洲部分地區(qū)豬丹毒時(shí)有發(fā)生，給我們敲醒警鐘，豬丹毒桿菌的毒性及耐藥性或許發(fā)生變化。諸多學(xué)者擔(dān)憂(yōu)疫苗還能否有效抵抗豬丹毒的攻擊。對(duì)臨床發(fā)病豬進(jìn)行鑒定、測(cè)試、分析，確定所分離細(xì)菌為豬丹毒桿菌，并以小鼠進(jìn)行毒菌及疫苗抗力試驗(yàn)，目的是為了為豬丹毒的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 樣本及方法

1.1 病原體及疫苗

某養(yǎng)豬場(chǎng)捐病豬 （肝、心、肺等器官），豬丹毒桿菌疫。

1.2 分離純化細(xì)菌

從病體各組織中提取無(wú)菌樣本置于恒溫中培養(yǎng)、觀察。選取可疑菌種培養(yǎng)并儲(chǔ)存。

1.3 菌株染色分離鏡撿

提取菌種涂片、染色并觀察。

1.4 試驗(yàn)對(duì)象

健康小鼠。

1.5 引物設(shè)計(jì)及PCR測(cè)試

（1）引物設(shè)計(jì)； （2）提取菌種DNA； （3）煮沸法制作DNA模板，選取多個(gè)菌落放置于100μl的ddH2O的EP管中；（4）PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

1.6 藥敏試驗(yàn)

抑菌圈直徑<10mm不敏感 (耐藥)，10～20mm中度敏感，>20mm高度敏感。

1.7 用小鼠進(jìn)行致病性細(xì)菌試驗(yàn)

將菌株分離純化再與5%犢牛血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋?zhuān)名準(zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管估算活菌數(shù)。再取一定數(shù)量的小鼠進(jìn)行試驗(yàn)；最后用Reed-Muench法計(jì)算小鼠的半數(shù)致死量 (LD50)；并對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢觀察。

1.8 試驗(yàn)豬丹毒疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)作用

分別取兩組小鼠進(jìn)行免疫和攻毒試驗(yàn)，在一定時(shí)間內(nèi)，對(duì)小鼠的體重、精神狀態(tài)及死亡情況等進(jìn)行記錄、分析，結(jié)果見(jiàn)附圖。

2 試驗(yàn)結(jié)論

（1）細(xì)菌的形狀。在血瓊脂平板培養(yǎng)24～48h后，出現(xiàn)纖細(xì)、針尖大小、露珠樣、半透明、表面光滑、邊緣整齊的白色小菌落，有α溶血現(xiàn)象；在含5%小牛血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)20h后出現(xiàn)渾濁。分離菌株經(jīng)革蘭染色鏡檢，在新培養(yǎng)基中，細(xì)菌呈典型的革蘭陽(yáng)性、長(zhǎng)短不一、有彎曲的桿菌，培養(yǎng)超過(guò)24h，細(xì)菌有長(zhǎng)絲狀。

（2）細(xì)菌16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增為豬丹毒桿菌。

（3）進(jìn)行豬丹毒桿菌和豬丹毒疫苗株G410T的藥敏試驗(yàn)。

（4）檢測(cè)豬丹毒桿菌的耐藥基因，分離豬丹毒桿菌存在氨基糖苷類(lèi)耐藥基因和四環(huán)素耐藥基因。

（5）試驗(yàn)細(xì)菌的致病性。

（6）試驗(yàn)豬丹毒弱疫苗的免疫攻毒保護(hù)性。

3 結(jié)論

通過(guò)從發(fā)病豬組織中分離并純化得到細(xì)菌，并通過(guò)驗(yàn)證細(xì)菌的經(jīng)形態(tài)特征、染色特性及PCR鑒定，最終確定為豬丹毒桿菌。并通過(guò)小鼠的試驗(yàn)證明豬丹毒桿菌的致病性。

豬丹毒桿菌的出現(xiàn)一定會(huì)造成抗生素的使用，而其耐藥性會(huì)影響細(xì)菌感染后的治療。在豬丹毒桿菌的耐藥基因檢測(cè)顯示，豬丹毒桿菌包括疫苗株中存在氨基糖苷類(lèi)aacC2、四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tetB，但沒(méi)有檢測(cè)到四環(huán)素耐藥基因tetA。同時(shí)，豬丹毒桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素有嚴(yán)重的敏感性。所以，豬場(chǎng)暴發(fā)疫情后的治療首選藥應(yīng)為β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。但在臨床用藥時(shí)藥敏試驗(yàn)高敏的藥物還不能完全達(dá)到預(yù)期效果。

附圖 小鼠免疫和攻毒后的平均體重

最后，豬丹毒疫苗免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗對(duì)小鼠是安全的，但由于本菌攻毒試驗(yàn)沒(méi)有在豬上進(jìn)行，為了不造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)豬丹毒的安全性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。