梁 娜，彭 西，吳邦元，方 靜*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川南充 637000）

在已知黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性和致癌性最強(qiáng)[1]。AFB1抑制動物生長[2]，有極強(qiáng)的肝腎毒性和免疫毒性[3]。AFB1可降低家禽免疫器官臟器指數(shù)[4]、血清抗體滴度[5]、TNF-α 和 IFN-γ 等細(xì)胞因子水平[6]，降低外周血和腸黏膜內(nèi)皮成熟T淋巴細(xì)胞比例[7]并誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡[8]。作為谷胱甘肽過氧化物酶等生物酶的組成成分，硒參與調(diào)控機(jī)體的氧化還原狀態(tài)[9]。適量硒可減少UVA輻射對細(xì)胞DNA的損傷[10]、緩解鎘和汞引起的氧化損傷[11-12]、緩解T-2毒素對軟骨和脾臟細(xì)胞的DNA損傷和凋亡[13-14]。日糧加硒可緩解AFB1所致的雛雞免疫器官的形態(tài)學(xué)損傷和過度凋亡[15]、鴨的肝臟功能紊亂以及肝細(xì)胞過度凋亡現(xiàn)象[16]。

前期研究表明，AFB1主要通過死亡受體通路和線粒體通路誘導(dǎo)雛雞胸腺細(xì)胞凋亡[8]，日糧加硒緩解AFB1誘導(dǎo)的雛雞胸腺細(xì)胞凋亡[17]，但其緩解機(jī)理尚不清楚。本試驗(yàn)旨在探究亞硒酸鈉對AFB1所致胸腺細(xì)胞死亡受體通路活化的緩解機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與日糧組成

將180只1日齡科寶肉雞健雛（購于成都市溫江區(qū)正大有限公司）隨機(jī)分為4組：對照組（0 mg/kg AFB1）、+Se 組（0.4mg/kg Se）、AFB1組（0.6mg/kg AFB1）和AFB1+Se組（0.6 mg/kg AFB1+0.4 mg/kg Se）。雛雞自由采食和飲水，試驗(yàn)期21 d。根據(jù)中國雛雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)推薦配方（NY/T33-2004）配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧。AFB1組日糧配制方法參見文獻(xiàn)[8]。分別在對照日糧和AFB1日糧中逐級混入0.4 mg/kg硒（以Na2SeO3為硒源），制得+Se和AFB1+Se日糧。經(jīng)高效液相色譜儀（HPLC，Milford，MA，USA）檢測，AFB1和對照日糧中AFB1的含量分別為0.601 mg/kg和＜0.001 mg/kg。于7、14和21 d時(shí)，每組隨機(jī)抽取5只雛雞剖殺，進(jìn)行下列指標(biāo)的檢測。

1.2 雛雞胸腺臟器指數(shù)

觀察胸腺的外觀變化，去除胸腺周圍結(jié)締組織，稱凈重并計(jì)算臟器指數(shù)：

臟器指數(shù)=臟器凈重（g）/空腹體重（kg）

1.3 組織病理學(xué)觀察

稱重后，立即將胸腺置于4%多聚甲醛磷酸緩沖溶液中固定24 h以上，脫水包埋，石蠟切片。蘇木素伊紅（H.E.）染色后于Olympus顯微鏡下觀察并記錄組織病理變化。

1.4 胸腺T淋巴細(xì)胞亞群檢測

取胸腺置于 4℃磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.2～7.6）中。經(jīng)機(jī)械剪碎法制成勻漿狀，過濾和離心后PBS洗兩次，重懸為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入Southern Biotech公司生產(chǎn)的單抗CD3-SPRD（8200-13）、CD4-FITC（8210-02）和 CD8-RPE（8220-09）各一頭份。4℃避光染色 15 min。PBS液洗滌后重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD，美國）檢測。分析 CD3+、CD3+CD4+和 CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分率并計(jì)算CD4+/CD8+的比值。

1.5 胸腺細(xì)胞凋亡檢測

1.5.1 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測胸腺細(xì)胞凋亡率

取上述單細(xì)胞懸液100 μL，加入凋亡試劑盒（51-66211E，BD Pharmingen，美國）中的 Annexin-V FITC和PI染液各5 μL，振蕩混勻，25℃避光染色15 min；加入 400 μL 1×結(jié)合緩沖液，混勻后流式細(xì)胞儀檢測并分析凋亡細(xì)胞百分率。

1.5.2 熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因的變化

將胸腺凍存于液氮備用。用研缽將胸腺磨成粉末狀，裝入無RNA酶EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肨riPure（11667165001，羅氏，德國）提取總 RNA。檢測總RNA濃度及A260/280值（控制在1.8～2.0之間）。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（04897030001，羅氏，德國）處理獲得cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?。用SYBR Green熒光染料（2043，DBI，德國）進(jìn)行熒光標(biāo)記后，用 Bio-Rad熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad，CFX96 touch，美國）進(jìn)行檢測。

PCR 反應(yīng)采用 20 μL體系：10 μL熒光染料、0.5 μL 正向引物、0.5 μL 反向引物、1 μL cDNA 模版、8 μL DEPC-H2O。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2 min，95℃變性10 s，50℃～60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；經(jīng)95℃ 1 min，55℃ 1 min，55℃～98℃（86個(gè)循環(huán)）獲取融解曲線?；蚓幪栍蒒CBI GenBank獲得，引物經(jīng)NCBI Blast比對設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程有限公司合成（見表1）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均數(shù)（M）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。并用單因素方差分析法分析組間差異，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 臟器指數(shù)

AFB1組胸腺臟器指數(shù)14 d時(shí)極顯著低于對照組和+Se組（P＜0.01）；21 d時(shí)顯著或極顯著低于對照組和+Se組（P＜0.05或 P＜0.01）。AFB1+Se組與其余各組間差異不顯著（P＞0.05）。見圖1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table1 Primer sequences，corresponding accession numbers and sizes of the amplification products

2.2 組織形態(tài)學(xué)

14和21 d時(shí)，對照組網(wǎng)狀細(xì)胞形態(tài)清晰，胞核大、染色質(zhì)淡染，其周圍的空隙中未見或僅見有少量細(xì)胞核碎片；與對照組比較，AFB1組雛雞胸腺皮質(zhì)區(qū)內(nèi)網(wǎng)狀細(xì)胞形態(tài)較模糊，其周圍的細(xì)胞核碎片明顯增多；與對照組比較，+Se組和AFB1+Se組未見明顯的病理形態(tài)學(xué)損傷（見圖2）。

2.3 T淋巴細(xì)胞亞群

由圖3可見，與對照組比較，14和21 d時(shí)，+Se組胸腺CD3+CD4+和CD3+CD8+細(xì)胞百分比顯著或極顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01）；AFB1組、AFB1+Se組胸腺 CD3+、CD3+CD4+和 CD3+CD8+細(xì)胞百分比顯著或極顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。

與AFB1組相比，14 d時(shí)，AFB1+Se組胸腺CD3+CD4+和 CD3+CD8+細(xì)胞百分比顯著升高（P＜0.05），CD4+/CD8+比值亦顯著升高（P＜0.05）。

2.4 凋亡率

與對照組比較，AFB1組胸腺細(xì)胞凋亡率極顯著升高（P＜0.01）；+Se組凋亡率在21 d時(shí)極顯著降低（P＜0.01）；AFB1+Se組無顯著變化（P＜0.05）。AFB1+Se組的胸腺細(xì)胞凋亡率與AFB1組比較顯著或極顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。圖4的流式象限圖直觀地顯示，AFB1組的胸腺細(xì)胞凋亡率較對照組高，AFB1+Se組較AFB1組低。

2.5 凋亡相關(guān)基因的mRNA相對定量變化

與對照組比較，AFB1組雛雞胸腺的Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9、Fas、TNF-α、FasL、JNK、ASK1和IKIP的mRNA表達(dá)量顯著或極顯著升高（P＜0.01或 P＜0.05）；Bid、Bcl-2 和 NF-kB1 的表達(dá)量顯著或極顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）；RIP的表達(dá)量在7和 14 d時(shí)顯著升高（P＜0.05）。

圖1 雛雞胸腺臟器指數(shù)變化Figure1 The relative weights of thymus in chickens

與對照組相比，+Se組雛雞胸腺的Fas、TNF-α、Caspase-8、JNK和ASK1的mRNA表達(dá)量升高（P＜0.01或P＜0.05），同時(shí)NF-kB1的mRNA表達(dá)量降低（P＜0.01 或 P＜0.05），而 Bcl-2、caspase-3 和 caspase-9的mRNA表達(dá)量無明顯變化（P＞0.05）。與 AFB1組相比，AFB1+Se 組雛雞胸腺的 TNF-α、caspase-8、caspase-3、caspase-9和JNK1的mRNA表達(dá)量降低（P＜0.01或 P＜0.05），Bcl-2和 Bid的 mRNA 表達(dá)量升高（P＜0.01 或 P＜0.05），而 Fas、NF-kB1和 IKK 的mRNA表達(dá)量無明顯變化（P＜0.05）。詳見圖5。

3 討論

3.1 AFB1及添加亞硒酸鈉后胸腺組織學(xué)變化

已有研究表明，AFB1可引起雛雞[4]和鴨[18-19]胸腺臟器指數(shù)降低。本試驗(yàn)中，AFB1組的胸腺臟器指數(shù)降低，與前人的研究結(jié)果相似。AFB1組雛雞胸腺中見多量核碎片，而+Se組和AFB1+Se組均無明顯病變，表明日糧中適量加硒可改善AFB1導(dǎo)致的雛雞胸腺臟器指數(shù)降低和組織形態(tài)學(xué)損傷。硒元素是含硒蛋白的重要成分，具有抗氧化、抗癌以及免疫調(diào)節(jié)作用[20]?；A(chǔ)日糧中添加0.4 mg/kg硒可改善AFB1所致的免疫緩解[17]，其機(jī)理可能與其減輕了雛雞胸腺的組織學(xué)損傷有關(guān)。

圖2 雛雞胸腺形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)Figure2 Pathological changes of thymus

圖3 雛雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群變化Figure3 Changes of the percentage of thymic T-cell subsets in chickens

圖4 雛雞胸腺細(xì)胞凋亡率變化Figure4 Changes of the percentage of apoptotic thymocytes in chickens

3.2 AFB1及添加亞硒酸鈉后胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的變化

胸腺是成熟T淋巴細(xì)胞分化的主要場所，而分化中的胸腺細(xì)胞對有害刺激較敏感[21]。AFB1可降低雛雞胸腺CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例[17]；與前人研究結(jié)果相似，本試驗(yàn)中0.6 mg/kg AFB1導(dǎo)致了胸腺T淋巴細(xì)胞亞群百分率降低，可能與胸腺細(xì)胞增殖受阻或淋巴細(xì)胞過度凋亡相關(guān)。與對照組比較，+Se組雛雞胸腺CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著降低，但CD4+/CD8+比值呈升高趨勢。有學(xué)者認(rèn)為，CD3+CD4+比例的減少并不是由于CD4+T細(xì)胞的損耗，而是機(jī)體為了維持自穩(wěn)態(tài)的一種代償性生理學(xué)機(jī)制[22]。CD3+CD4+細(xì)胞以輔助性T細(xì)胞為主[23]，CD4+/CD8+比值的升高表明CD3+CD4+T細(xì)胞相對增多，提示機(jī)體免疫反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)能力相對增強(qiáng)。結(jié)合組織學(xué)未見明顯損傷的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，此變化可能反映了機(jī)體的代償性調(diào)節(jié)[22]。

日糧中添加適量硒可緩解AFB1對雛雞免疫系統(tǒng)[18]、肝臟[24]和腎臟[25]的損傷作用。日糧加硒可改善AFB1所致的雛雞胸腺CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的比例下降[17]。本試驗(yàn)與已有研究結(jié)果一致，AFB1+Se組胸腺CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的比例及CD4+/CD8+比值比AFB1升高。表明0.4 mg/kg亞硒酸鈉可緩解AFB1誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞成熟分化受阻現(xiàn)象。

3.3 AFB1及添加亞硒酸鈉后胸腺細(xì)胞凋亡率的變化

AFB1可誘導(dǎo)大鼠[26]、雛雞[27]和豬[28]的胸腺細(xì)胞凋亡增加；而適量硒添加可降低AFB1導(dǎo)致的雛雞胸腺、法氏囊[29]和腎臟[25]等器官的細(xì)胞過度凋亡現(xiàn)象。本試驗(yàn)中，與對照組相比，AFB1組胸腺細(xì)胞凋亡率升高，AFB1+Se組凋亡率變化不明顯，表明0.6 mg/kg AFB1使胸腺細(xì)胞凋亡增加，而0.4 mg/kg硒可降低AFB1誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞過度凋亡。我們的前期研究表明，AFB1可能通過活化線粒體通路和死亡受體通路來介導(dǎo)雛雞胸腺細(xì)胞過度凋亡[8]，本試驗(yàn)對死亡受體通路中相關(guān)因子的檢測顯示，AFB1可增加 RIP、caspase-8、caspase-9、caspase-3、Fas、FasL、ASK1、IKIP和JNK的mRNA相對表達(dá)量，下調(diào)Bcl-2、NF-kB1和Bid的mRNA相對表達(dá)量。表明此凋亡增加過程中有死亡受體通道上的3條下游途徑參與：①通過Fas-FasL-FADD-caspase8-caspase3途徑直接誘導(dǎo)凋亡；②通過Fas-ASK1-JNK-Bcl-2途徑，并在線粒體的介導(dǎo)下，啟動下游調(diào)控因子caspase-9和caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。③通過TNF-α-RIP1-IKIP-NF-kB1-caspase-3信號途徑誘導(dǎo)凋亡。

本試驗(yàn)中，+Se組的胸腺細(xì)胞凋亡率與對照組相比無明顯變化；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)as、TNF、Caspase-8、JNK 和 ASK1的 mRNA 表達(dá)量升高，NF-kB1的mRNA表達(dá)量降低，表明+Se組胸腺細(xì)胞的死亡受體通路被活化。關(guān)于適量硒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象多見于腫瘤[30]。本試驗(yàn)+Se組胸腺的死亡受體通路有活化但凋亡率變化不明顯，其機(jī)理有待研究。

硒能夠減輕有毒物質(zhì)和藥物引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)[31]，緩解T-2毒素和脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13，32]。在硒緩解鎘引起的細(xì)胞凋亡率增加時(shí)，其機(jī)理可能與ASK1的活性降低，繼而降低JNK的磷酸化作用，減輕Bcl-2的磷酸化而阻斷了線粒體通道的活化[33]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與AFB1組相比，AFB1+Se組胸腺細(xì)胞凋亡率顯著降低，TNF-α、caspase-8、caspase-3、caspase-9和 JNK1的mRNA表達(dá)量降低，Bcl-2和tBid的mRNA表達(dá)量升高。該結(jié)果表明，在上述AFB1導(dǎo)致活化的3條死亡受體通路下游途徑中，日糧中適量加硒可能阻斷途徑①和②：即通過降低caspase-8的表達(dá)降低caspase-3的活化程度，達(dá)到緩解雛雞胸腺細(xì)胞凋亡的作用；通過緩解JNK信號通路以減輕對Bcl-2的磷酸化作用；通過緩解JNK信號通路以減輕對Bcl-2的磷酸化作用[34]，從而降低caspase-8對tBid的磷酸化來減輕線粒體損傷[35]，最終降低caspase-9和caspase-3的活性表達(dá)來降低雛雞胸腺細(xì)胞的凋亡率。另有研究顯示，在適量硒添加可以降低巨噬細(xì)胞IKK的活性，從而緩解脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[36]，IKK具有緩解NF-kB1的作用。但是AFB1+Se組雛雞胸腺細(xì)胞NF-kB1的表達(dá)量與AFB1組相比并未呈現(xiàn)升高，表明未通過阻斷NF-kB1途徑的活化來緩解胸腺細(xì)胞凋亡。