黎 民, 常學輝, 張良芝, 雷 震, 羅 申

(1. 周口市中醫(yī)院, 周口 466000; 2. 河南中醫(yī)藥大學, 鄭州 450002;3. 河南省中醫(yī)院中心實驗室, 鄭州450002)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中、老年人常見的運動障礙性疾病，是一種以中腦黑質-紋狀體多巴胺能神經元變性缺失，伴胞質內Lewy小體形成為特征性改變的神經系統(tǒng)變性疾病，鑒于其確切發(fā)病機制仍不清楚[1,2]，PD基礎研究目前仍是國內外神經病學專家關注的重點。

6-羥基多巴胺(6-OHDA)建立的PD大鼠模型因造價低、方法簡單、模型穩(wěn)定等優(yōu)點，已被廣泛應用于PD的基礎研究[3]。目前PD大鼠模型成功率差別較大，原因在于建立PD大鼠模型的影響因素較多，其難點在于注射位點及6-OHDA注射劑量的選擇。在查閱大量文獻的基礎上，本實驗選擇應用最多的注射位點: 中腦黑質致密區(qū)、中腦腹側被蓋區(qū)及紋狀體，進行分組實驗，探索一種更為理想的PD大鼠模型建立方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠76只, 體質量180～220 g,購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(晉)2015-0001]。飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司生產[許可證號: (2014)01008], 墊料為玉米芯。實驗在河南省中醫(yī)院中心實驗室[SYXK(豫)2011-0002]進行, 飼養(yǎng)于大鼠IVC, 明暗交替12 h∶12 h,溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%。適應性喂養(yǎng)1周后, 無不良反應, 開始實驗, 并按實驗動物使用3R原則給予人道關懷。

1.2 主要實驗藥物與試劑

6-OHDA，維生素C(AR，99%), 購自上海源葉生物科技有限公司, 鹽酸阿樸嗎啡, 購自中國藥品檢定研究院, 絡氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase, TH)抗體購自美國 Cell Signaling公司。

1.3 主要儀器設備

大鼠腦立體定位儀(美國Stoelting公司)，電動顱骨鉆(安徽正華生物儀器設備有限公司)，大鼠IVC(馮氏實驗動物設備有限公司)，電子精密天平(德國賽多利斯公司)。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組及模型建立 將76只SD大鼠按隨機數字表法分為4組, 其中中腦單點組22只、中腦雙點組22只、紋狀體單點雙注組22只、對照組10只, 使用大鼠腦立體定位儀定位, 參照文獻[4]方法,按照分組情況建立PD大鼠模型。(1) 中腦單點組: 中腦黑質致密部(SNC)單點坐標A/P(距前囟中心后):-5.0 mm、L/R(距前囟中心左右): -1.7 mm、O/V(距腦膜表面深度): -7.6 mm; 單點注入6-OHDA溶液(2 mg/mL) 12 mL。(2)中腦雙點組: 中腦黑質致密部A/P: -5.0 mm、L/R: -1.7 mm、O/V: -7.6 mm; 中腦腹側被蓋區(qū)A/P: -4.6 mm、L/R: -0.9 mm、O/V:-7.3 mm; 每點注入6-OHDA溶液(2 mg/mL) 6 mL。(3) 紋狀體單點雙注組: 紋狀體單點雙注A/P: -1.0 mm、L/R: -2.7 mm、O/V: -5.2 mm和O/V: -6.0 mm; 單點注入6-OHDA溶液(2 mg/mL) 12 mL，分2次注射。(4) 對照組: 中腦黑質致密部(SNC)單點坐標A/P:-5.0 mm、L/R: -1.7 mm、O/V: -7.6 mm; 單點注入質量分數0.02%維生素C溶液12 mL。

分別在造模后1周、2周、4周、8周腹腔注射誘導劑APO 0.5 mg/kg, 誘發(fā)大鼠向健側旋轉, 注射后觀察大鼠行為學變化并記錄其30 min內旋轉的圈數。若大鼠恒定向健側旋轉且旋轉圈數≥7 r/min,則為造模成功; 若大鼠旋轉圈數＜7 r/min或者15 min內無旋轉，則為造模失敗。

1.4.2 取材與指標檢測 各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，注射后8周行為學檢測完畢后，將所有大鼠腹主動脈取血后斷頭取腦，在冰盤上快速完整剝離腦組織，生理鹽水清洗后放入體積分數10%多聚甲醛中4 ℃固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，切片(厚5 μm)。按照試劑盒說明書進行HE染色和酪氨酸羥化酶(TH)免疫組織化學染色; 利用Leica顯微照相系統(tǒng)和Biosens Digital Imaging System圖像采集系統(tǒng)對TH免疫組織化學染色圖像(細胞質棕褐色為陽性細胞)進行分析, 先用低倍鏡選擇陽性表達的區(qū)域, 再利用高倍鏡(400×)在切片的同一區(qū)域, 隨意選擇5個視野, 收集5組數據, 其平均值則為平均積分光密度(Integrated optical density, IOD), 其值表示指標表達強度。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS22.0進行統(tǒng)計分析，造模成功率用%表示，大鼠旋轉圈數及TH免疫組化陽性細胞IOD值以表示，各組數據符合正態(tài)分布和方差齊性的采用單因素方差分析，如不符合正態(tài)分布和方差齊性則采用多個相關樣本的非參數檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠模型行為學檢測

造模后3 d內中腦雙點組大鼠死亡2只，紋狀體單點雙注組死亡1只，對照組死亡2只，最終中腦單點組22只，中腦雙點組20只，紋狀體單點雙注組21只，對照組8只大鼠進入統(tǒng)計結果。典型PD大鼠模型在注射APO后數秒至數分鐘內即可出現向健側的旋轉行為，以左后肢為支撐點，頭尾相連，身體約成環(huán)形，原地旋轉，時有嗅探、覓食及弓背等動作。

造模1周時經APO誘導，中腦單點組造模成功13只，中腦雙點組成功9只，紋狀體單點雙注組成功7只，對照組大鼠無旋轉行為(表1)，各周及最終各組造模成功率詳見表1，各組間造模成功率均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

中腦單點組經APO誘導，1周時PD模型大鼠平均旋轉圈數為(7.3±0.2) r/min，其后逐漸增加；中腦雙點組和紋狀體單點雙注組平均旋轉圈數亦有相似的變化趨勢，相同時間點各組間平均旋轉圈數差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見表2。

2.2 大鼠模型損毀側TH免疫組織化學陽性細胞IOD值

中腦單點組、中腦雙點組及紋狀體單點雙注組大鼠損毀側TH陽性細胞IOD明顯比對照組小(P＜0.01); 中腦單點組大鼠損毀側TH陽性細胞IOD比中腦雙點組及紋狀體單點雙注組小(P＜0.05); 中腦雙點組大鼠損毀側TH陽性細胞IOD比紋狀體單點雙注組小(P＜0.05)(表3)。

表1 PD大鼠造模成功率 n(%)

表2 PD大鼠旋轉行為變化 r/min

表3 PD大鼠損毀側TH免疫組化陽性細胞IOD值

2.3 病理學觀察

2.3.1 損毀側HE染色 對照組大鼠神經元相對密集, 排列整齊, 胞漿豐富, 未見皺縮, 胞核居中(圖1A);紋狀體單點雙注組和中腦雙點組成功PD大鼠的神經元變性、壞死，細胞數明顯減少，細胞空泡變性, 殘留細胞皺縮, 排列散亂(圖1B、圖1C); 中腦單點組成功PD大鼠的神經元大量變性、壞死，細胞數量明顯減少, 散在分布, 殘留細胞皺縮(圖1D)。

2.3.2 損毀側TH免疫組織化學染色 對照組大鼠損毀側TH陽性細胞數量較多，胞體較大突起較為明顯(圖2A); 紋狀體單點雙注組、中腦雙點組及中腦單點組成功PD大鼠損毀側TH陽性細胞數較對照組明顯減少，散在分布，而中腦單點組TH陽性細胞數最少(圖2B、C、D)。

3 討論

Ungerstedt[5]于1968年首次報道了采用6-OHDA建立PD大鼠模型，認為動物旋轉模型的某些特點與人類PD相似。6-OHDA是一種神經毒素，與DA在分子結構上相似，但不能夠通過血腦屏障，需腦內局部定位注射才能損毀中樞神經系統(tǒng)細胞。注射到中腦黑質的6-OHDA與DA競爭性進入細胞，其化學性質不穩(wěn)定，能在細胞內外自動氧化為6-羥多胺醌(6-OHDAO)和活性氧(ROS)，單胺氧化酶(MAO)誘導其生成H2O2，Fe2+與H2O2進行反應，產生羥自由基，作用于細胞膜, 引發(fā)細胞脂質化、蛋白和DNA結構的變化[6,7]。另外, H2O2可對線粒體氧化呼吸鏈產生直接的抑制作用，引起細胞能量衰竭, 最終使黑質-紋狀體通路DA能神經元的變性、缺失, 從而使DA受體處于超敏狀態(tài)。APO是DA受體激動劑，在注射APO后，損毀側受體數量增多，高敏感使健側肢體產生PD癥狀，運動遲緩、肌強直，雙側運動不能平衡而向健側旋轉[8]。雖6-OHDA定位注射誘導的PD動物模型黑質內并沒有典型的Lewy小體形成，但能夠產生與人類PD相似的病理及生化表現, 包括黑質DA能神經元變性死亡、膠質細胞增生、黑質紋狀體(TH)活性和DA含量降低等[9]。因此，此法成為制造PD動物模型的常用方法。

圖1 大鼠腦組織HE染色觀察

圖2 大鼠腦組織TH免疫組織化學染色觀察

目前，利用6-OHDA建立PD大鼠模型的方法中，主要的注射部位有中腦黑質致密區(qū)、中腦腹側被蓋區(qū)及紋狀體等，中腦黑質致密區(qū)是DA能神經元最密集的部位；腹側被蓋區(qū)因解剖范圍小，常發(fā)生變異，不便于定位，單獨應用的模型成功率不高; 紋狀體范圍大，易于定位，通過DA能神經元末梢對6-OHDA的吸收，使其發(fā)生逆行性變性，從而破壞中腦黑質DA能神經元。

本文選擇中腦單點、中腦雙點和紋狀體單點雙注進行對比實驗，結果顯示中腦單點組造模成功率為72.7%，中腦雙點組成功率比中腦單點組低(P＜0.05)，為60.0%, 可能與中腦雙點組中每點的6-OHDA劑量比中腦單點組低有關; 而紋狀體單點雙注組造模成功率最低(P＜0.05), 為47.6%，原因可能是紋狀體范圍過大, 與黑質致密區(qū)和腹側被蓋區(qū)相比, 相同劑量的6-OHDA損毀的DA能神經元數量有限。中腦單點組經APO誘導，1周時成功PD模型平均旋轉圈數為(7.3±0.2) r/min; 2周、4周時均較前增加(P＜0.05); 8周時較前差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。中腦雙點組和紋狀體單點雙注組平均旋轉圈數亦有相似的變化趨勢，表明6-OHDA建立的PD大鼠模型具有較強的穩(wěn)定性。TH被普遍認為是對包含DA在內的兒茶酚胺類神經遞質的合成有重要影響的第一限速酶, 細胞表達TH是判斷神經元為多巴胺能神經元的的金標準[10]。本實驗對各組成功PD大鼠損毀側進行TH免疫組織化學染色, 發(fā)現中腦單點組、中腦雙點組及紋狀體單點雙注組TH陽性細胞數明顯少于對照組(P＜0.01), 驗證了6-OHDA建立PD大鼠模型的可靠性。造模3 d內中腦雙點組死亡2只, 紋狀體單點雙注組和對照組各死亡1只,而中腦單點組未出現死亡。大鼠的死亡除了與定位鉆孔對大鼠的損傷有關之外, 還與6-OHDA對損毀區(qū)細胞的破壞和操作過程中的人為因素有關。

綜上所述，本實驗中腦單點組24 μg 6-OHDA在中腦黑質致密區(qū)單點注射建立PD大鼠模型，操作過程相對簡便, 成功率高, 模型穩(wěn)定, 且動物死亡率低，是一種較為理想的PD大鼠模型建立方法。