楊國淋, 魏 玲

(1. 川北醫(yī)學院實驗動物中心, 南充 637000;2. 南充職業(yè)技術學院農(nóng)業(yè)科學技術系, 南充637131)

實驗動物和動物實驗是生理、病理以及藥理學等醫(yī)學研究的重要手段。對于醫(yī)學研究者來說,由于臨床過程中受倫理和標本的限制，多數(shù)研究不可能直接用人體進行實驗, 必須依賴于實驗動物[1]。因此，動物實驗是醫(yī)學生從理論到臨床實踐一個重要的橋梁。開放性實驗是學生在已經(jīng)系統(tǒng)學習了相關理論知識后，充分發(fā)揮科研思維能力和主觀能動性，在教師的協(xié)助下完成實驗操作和研究項目的過程，整個實驗過程中學生占實驗者的主要位置[2]。近年來由于實驗動物學的發(fā)展，已經(jīng)有多種實驗動物疾病模型被應于醫(yī)學研究[3-5]，如膽汁性肝硬化門脈高壓模型、急性肝衰竭動物模型、大鼠脾臟全切除模型、胃食管返流病動物模型、管式空腸造瘺術、腦出血(ICH)動物模型、高血壓大鼠模型和Ⅱ型糖尿病動物模型等。動物實驗外科手術主要是研究在患病動物或健康動物體上進行手術，以達到診斷、治療疾病和建立醫(yī)學實驗動物模型的目的，通過外科手術方法切除某些內(nèi)分泌腺或消化腺體, 進行內(nèi)分泌、行為學和消化功能影響的研究。

脾臟是機體重要的免疫器官，具有是消化吸收, 轉輸營養(yǎng)物質(zhì), 運化水液, 統(tǒng)攝血液的關系。在傳統(tǒng)的中醫(yī)理論中，脾臟是一個十分重要的綜合器官, 不僅僅是包括現(xiàn)代醫(yī)學中所說的脾臟，也還包括淋巴組織和胰腺組織, 若脾氣不足, 將導致腹瀉、食欲減退、亞健康等癥狀。Zhen等[6]用SD大鼠構建脾氣不足的模型，探究補中益氣湯對脾氣不足的SD大鼠的恢復作用和潛在機制; Choi等[7]用黑砂養(yǎng)胃湯對SD大鼠不同時間段胃、脾臟、胰腺細胞的處理, 結果表明黑砂養(yǎng)胃湯有抗氧化的作用。為研究脾臟的功能, 以及脾臟切除后對消化、內(nèi)分泌、行為學的影響, 脾臟切除模型的研究也很廣泛。早在1988年葛依工等[8]對大鼠脾臟切除研究外周血T細胞亞群變化影響的動態(tài)觀察，證實了脾臟對外周血T細胞亞群分布的調(diào)節(jié)作用。張炳俊等[9]通過對SD大鼠進行脾切除后，然后采用線栓法建立大腦中動脈閉塞(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)模型，探討脾切除對大鼠腦梗塞的影響及其可能機制，研究脾臟與腦梗塞之間的關系。李梅等[10]研究脾臟切除對實驗性腦損傷SD大鼠死亡率、血液中白細胞介素-1β(IL-1β)的濃度以及致傷區(qū)腦組織IL-1β mRNA含量的影響,為提高重型顱腦創(chuàng)傷患者救治水平提供了新思路。

本文主要論述了我校實驗動物學教研室對SD大鼠脾臟切除開放性實驗教學，開展此脾臟切除手術旨在培養(yǎng)醫(yī)學生的動手能力、科研思維能力，鍛煉臨床醫(yī)學生的手術操作技巧，為他們今后從事臨床外科手術和科學研究打下基礎，也為其他醫(yī)學院校開展動物實驗外科教學和脾臟的機制研究提供一定的參考價值。

1 動物來源及主要器材

清潔級雄性SD大鼠, 體質(zhì)量 180～220 g, 由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供[SCXK(川)2013-0018]，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中[SYXK(川)2013-0076]。動物麻醉劑: 10%水合氯醛; 常規(guī)手術器械: 組織剪、手術刀、縫合針、1號縫合線、紗布、酒精、碘伏、注射器等由川北醫(yī)學院實驗動物中心實驗室提供。

2 大鼠脾臟切除手術具體操作流程

大鼠禁食、禁水8 h。整個手術在在常規(guī)實驗室完成，但是整個手術過程嚴格要求學生按照無菌原則進行，避免手術過程中動物感染。

整個大鼠脾臟切除手術嚴格模擬臨床手術過程中的注意事項和操作。每次實驗一般為10個小組,3～4人為一個實驗小組，分為主刀手、第一助手、第二助手和麻醉師，分工明確，知曉職責。在手術前先進行理論知識的回顧和復習: 主要涉及大鼠的生物學特性、解剖學特性、脾臟在解剖學上的位置、大鼠的固定、抓取，腹腔注射、無菌知識、手術器械的分類和使用、動物福利等內(nèi)容。其次向?qū)W生介紹本開放性動物實驗手術過程中的流程，主要包括: ①大鼠的固定; ②稱重; ③麻醉; ④切口;⑤結扎; ⑥脾臟切除; ⑦縫合; ⑧術后護理。

給學生播放視頻，展示脾臟切除的全過程，并在播放過程中，涉及到關鍵技術部分提醒學生注意。接下來老師對此手術示教，在示教過程中要求學生全場保持安靜。

學生開始自主實驗，并在實驗中給予指導。

2.1 大鼠的保定

在大鼠抓取的前提醒學生帶防護手套，以免被咬傷或抓傷。抓取方法: 右手輕輕抓住SD大鼠尾巴的中部并提起，然后迅速放在網(wǎng)格狀籠蓋上或其他粗糙面上，左手順勢按在大鼠軀干背部，稍加壓力向頭頸部滑行，以左手拇指和食指捏住大鼠兩耳后部頭頸皮膚，其余三指和手掌握住大鼠背部皮膚，使得大鼠的頭不能反咬，并將其保持仰臥位，完成抓取保定。大鼠保定操作如圖1和圖2。

2.2 麻醉

首先使用精度為0.1 g的電子稱重SD大鼠，然后按3 mL/kg水合氯醛(10%濃度)腹腔注射麻醉。具體操作方法如下: 左手固定好動物，將腹部朝上。右手持注射器將針頭在下腹部白線稍左或偏右的位置，從下腹部朝頭方向平行地刺入皮下，進針3～5 mm，再使針頭與皮膚呈45°斜穿過腹肌，當針頭穿過腹肌進入腹腔時，有落空感，然后固定針頭，保持針尖不動，回抽，無回血，無腸液等, 可緩緩推入麻醉劑。麻醉后觀察動物的反應,2 min左右，動物將不能自主活動，表現(xiàn)為站立不穩(wěn), 眼睛微閉; 5 min時可見動物完全麻醉，刺激胡須和尾尖無反應, 眼睛閉合，呼吸減慢等癥狀。

2.3 切口

待動物完全麻醉后，用大鼠固定板，腹面朝上固定四肢和頭部，并用鑷子將舌頭延伸至嘴角，以免發(fā)生窒息。用動物專用剃毛電推刀，將左側上腹部位置區(qū)域的毛剃干凈，裸露皮膚，找到脾臟大致位置，脾臟是在上腹部胃的下面，即左前肢內(nèi)側向下2～3指位置。找到此位置，碘伏消毒，蓋上無菌創(chuàng)巾，在創(chuàng)巾上剪開一個3 cm左右小孔，由助手將皮膚繃緊，主刀手慢慢的進行開口1.5～2 cm(圖4)，注意開口要平整，鈍性分離肌肉層，露出腹膜，慢慢的將腹膜用鑷子提起，切開，用鈍性鑷子緩慢在腹腔內(nèi)探查脾臟(圖5，箭頭指向處為脾臟位置)。

圖1 大鼠抓取

圖2 大鼠保定

圖3 大鼠麻醉

2.4 脾臟切除及縫合

找到脾臟后，將其小心挑出，置于創(chuàng)巾上，可以清晰看見在脾系膜上有很多小血管和幾根主動脈血管與脾臟相連，1 號線結扎脾門血管近心端和遠心端，從中間切斷脾動脈，脾臟即切除。檢查無出血后，將組織黏膜用生理鹽水沖去血漬等殘留物，然后還回腹腔。進行縫合，縫合分為先縫合肌肉層，再縫合皮膚層，對腹膜腹肌采用連續(xù)縫合，皮膚采用斷針縫合方式(圖6)。脾臟切除手術完成后，待動物蘇醒后，將其放在IVC籠具(類似于屏障系統(tǒng))內(nèi)單籠飼養(yǎng)，手術后溫度在25℃左右。在術后12 h內(nèi)動物飲水里面加入20%葡萄糖或維生素C，之后按照正常飼養(yǎng)條件每日定時喂養(yǎng)，每周更換墊料2次。每日觀察動物健康狀況，一周后記錄動物的存活率。

3 小結與討論

如何開展動物開放性實驗，開展什么類型的動物實驗，是目前醫(yī)學院校討論的焦點，多數(shù)院校也在根據(jù)學校的資源和學生素質(zhì)等基本情況，進行不斷創(chuàng)新和探索。呂開陽等[14]將Kinect體感技術運用于動物開放性外科實驗，彌補計算機輔助教學中的不足。動物開放性實驗還能培養(yǎng)醫(yī)學生的倫理意識，培養(yǎng)學生敬畏生命、善待實驗動物的仁者之心[15]?；铙w動物開放性實驗能夠培養(yǎng)學生的獨立思考、動手能力、團隊合作能力，對于初次接觸的醫(yī)學生來說對于培養(yǎng)他們的勇氣與膽量、無菌觀念以及如何正確使用常規(guī)手術器械都有重要的意義。多數(shù)動物實驗操作與醫(yī)學生在以后工作中的臨床實習中具有一定的相似性，開放性實驗能夠讓學生更加熟練常規(guī)手術操作，同時養(yǎng)成規(guī)范熟練的動手能力和心理素質(zhì)，為學生今后的臨床實習與醫(yī)療實踐打下堅實的基礎。

圖4 脾臟切除開口位置

圖5 大鼠腹部臟器位置

圖6 大鼠脾臟切除及縫合

建立SD大鼠脾臟切除外科手術，能夠把實驗動物外科手術的基本知識和基本方法、基本操作原則、原理和材料等聯(lián)系起來，如手術感染途徑及消毒滅菌法, 注射需要遵循的原則及并發(fā)癥和預防處理, 麻醉的分類、方法及麻醉意外處理, 手術基本技術的組織分離的原則、組織分離方法、縫合的基本原則、縫合材料、縫合的種類、組織縫合注意事項等。在理論課學習的同時, 實驗課著重練習和掌握外科操作的基本技術。如動物的抓取保定、試品的給予、 麻醉、 打結、組織分離和縫合等基本操作，也能夠充分讓學生理解和體會到動物福利，3R原則等抽象概念。本實驗的教學的目的是培養(yǎng)臨床醫(yī)學生外科手術的基本功底, 熟練掌握手術的基本技術和常用動物實驗手術方法。

SD大鼠脾臟切除實驗是目前研究比較成熟的一項實驗動物外科手術，能夠?qū)⒗碚撝R和實踐操作緊密聯(lián)系起來，培養(yǎng)學生的動手能力、心理素質(zhì)和科研思維。我校實驗動物中心一直將脾臟切除術作為學生的開放性實驗，具有專業(yè)的老師授課，成熟的技術，豐富的經(jīng)驗。每年我校學生還會定期舉辦一次全校規(guī)模的以脾臟切除手術為主的實驗動物技能操作大賽，以此加深學生對實驗動物和動物實驗的理解與宣傳。醫(yī)學生的臨床技能大賽、臨床手術、以及科研能力等都能得到極大的培養(yǎng)。

筆者實驗室長期為學生開設脾臟切除外科手術，具有豐富的經(jīng)驗。SD大鼠脾臟切除手術過程經(jīng)學校實驗動物倫理委員會審查，在整個動物實驗教學過程中，極引導學生樹立善待動物，尊重生命的倫理觀，加強實驗動物福利及“3R”原則的系統(tǒng)教育，消除學生在動物實驗過程中所遇到的倫理困惑，培養(yǎng)醫(yī)學生正確的科學觀。SD大鼠脾臟切除手術過程主要要注意一下幾點: ① 麻醉的劑量，在麻醉過程中由于個體之間的差異，我們一般是先按體質(zhì)量算出麻醉劑量，腹腔注射3/4麻醉計算量，在手術過程中觀察動物反應，如發(fā)現(xiàn)動物有明顯的疼痛反應，再適當增加麻醉劑量，不能一次性超量注射麻醉劑，因為過量麻醉，在脾臟切除過程中極易造成動物中途死亡。② 開口一般保持在1.5～2 cm左右，切口平整，便于縫合，不然很容易引起動物后期傷口感染。③ 術后護理不僅是對人很重要，對動物也是十分重要，按照動物福利給予足夠的關懷。一般經(jīng)過培訓學習后，學生能獨立完成此實驗動物手術操作，并對外科手術十分感興趣。一周之后SD大鼠的傷口恢復良好，且存活率能達到90%以上。

開展此動物開放性實驗對于學生來說是多方面的培養(yǎng), 動手能力，科研思維能力，心理素質(zhì)和團隊之間的分工協(xié)作能力，望我校此外科實驗能為其他醫(yī)學院校的開展開放性動物實驗提供一定參考。