曲雷鳴, 李 峰, 龔 偉, 劉 威

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院, 沈陽 110032; 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 大連116600)

鹿茸為傳統(tǒng)名貴中藥, 因具有“壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒”等功效[1], 廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床與日常保健中。鹿茸由于其藥材的來源，鹿角生長(zhǎng)特點(diǎn)，以及加工方式、切制的部位等差異，導(dǎo)致鹿茸藥材的規(guī)格紛繁復(fù)雜, 價(jià)格迥異等問題，且鹿茸藥材的藥效物質(zhì)不明確, 目前尚無行之有效的方法對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。又因鹿茸具有強(qiáng)筋健骨的功效，常用于骨質(zhì)疏松癥的治療。本研究嘗試采用血清藥理學(xué)方法，比較不同規(guī)格鹿茸商品藥材對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖及誘導(dǎo)成骨分化的影響，并在測(cè)定BMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中相關(guān)指標(biāo)的基礎(chǔ)上本研究首次采用主成分分析(PCA)，為鹿茸藥材的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新的方法, 也可對(duì)鹿茸藥材規(guī)格進(jìn)行科學(xué)、有效的劃分。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠72只, 體質(zhì)量(250±20) g,由長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(遼)2010-0001]。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠BMSCs購(gòu)于賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司，批號(hào)090405B01。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

鹿茸藥材分別購(gòu)于各藥材市場(chǎng)，分別為梅花鹿二杠蠟片、梅花鹿二杠二茬蠟片、梅花鹿三岔蠟片、梅花鹿二杠白片、梅花鹿二杠血片、馬鹿蓮花蠟片、馬鹿單門血片和馬鹿三岔白片，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室李峰老師鑒定，均為鹿科動(dòng)物梅花鹿 (Cervus Nippon Temminck或馬鹿 (Cervus elaphus Linnaeus) 的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，給藥前粉碎藥材，過80目篩，加50℃蒸餾水，制成0.1 g/mL的混懸液，備用。

1.4 試劑

BMSCs完全培養(yǎng)基、BMSCs成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS), 均購(gòu)自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司; PBS平衡鹽溶液(干粉)購(gòu)于中國(guó)Solarbio公司; 0.25%胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自德國(guó)Sigma公司; 大鼠堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(批號(hào)201306)、大鼠骨形成蛋白2(BMP-2)試劑盒(批號(hào)201306)、大鼠骨鈣素(BGP)試劑盒(批號(hào)201305) 均購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.5 儀器

Infinite M2000多功能酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司); CK-40F200倒置顯微鏡(日本Olympus公司);MR1822型低溫高速離心機(jī)(法國(guó)Beckman公司);DHG-9241A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); BH-2型生物顯微鏡(日本Olympus公司);MS1型迷你振蕩器(廣州儀科有限公司)。

1.6 溶液配制

1.6.1 BMSCs不完全培養(yǎng)液 配制前的30 min，室溫溶解雙抗(青霉素、鏈霉素)5 mL, 谷氨酰胺5 mL,將培養(yǎng)基添加物各個(gè)成分加入BMSCs完全培養(yǎng)基440 mL中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 含體積分?jǐn)?shù)10% FBS BMSCs完全培養(yǎng)液 將FBS放置2～8 ℃過夜至完全溶解，與BMSCs不完全培養(yǎng)基按比例配制成含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的BMSCs完全培養(yǎng)基。

1.6.3 含0.5% FBS BMSCs培養(yǎng)液 將FBS與BMSCs不完全培養(yǎng)基按比例配制成含體積分?jǐn)?shù)0.5% FBS的BMSCs培養(yǎng)基。

1.6.4 不同濃度鹿茸含藥血清培養(yǎng)液 SPF級(jí)SD大鼠72只，隨機(jī)分為9組，8種不同規(guī)格鹿茸組每組8只，每日給藥劑量為4 mL/kg，灌胃鹿茸混懸液，對(duì)照組8只，灌胃等量蒸餾水。以上各組均每日給藥2次, 連續(xù)給藥5 d。末次灌胃1 h后, 10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g體質(zhì)量), 行腹主動(dòng)脈采血, 4 ℃冰箱靜置3 h后, 離心30 min(3 000 r/min)，收集血清，使用前用BMSCs不完全培養(yǎng)液，稀釋成10%濃度的含藥血清。

1.6.5 BMSCs成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基 分別將FBS 20 mL, 抗壞血酸 400 μL，β-甘油磷酸鈉 400 μL，青鏈霉素2 mL和谷氨酰胺溶液2 mL，地塞米松溶液20 μL加入BMSCs不完全培養(yǎng)液中，制成含大鼠血清為10%BMSCs成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.7 細(xì)胞株培養(yǎng)

大鼠BMSCs接種于50 mL培養(yǎng)瓶中, 置于37 ℃,體積分?jǐn)?shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后, 每3 d換液1次, 繼續(xù)培養(yǎng), 待用。

1.8 鹿茸含藥血清對(duì)BMSCs增殖的影響

1.8.1 檢測(cè)方法 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用BMSCs完全培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為4×l04/ mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL。將培養(yǎng)板移入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，換用0.5% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細(xì)胞同步化，24 h后吸棄培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分為11組，分別為:10% FBS組、10%正常大鼠血清組(空白組)、誘導(dǎo)液組(加入BMSCs成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，作為陽性對(duì)照組)和8個(gè)不同品質(zhì)鹿茸組。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，每孔加入含不同血清的培養(yǎng)液 200 μL，設(shè)沒有接種細(xì)胞的培養(yǎng)孔為調(diào)零孔，分別于藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液各10 μL，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后，吸棄孵育液，每孔加入DMSO 100 μL，室溫振蕩15 min，混勻，待沉淀充分溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度(A)值，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。

1.8.2 檢測(cè)方法 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs, 按照傳代操作要求用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含10% FBS的BMSCs完全培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為2×104/mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔體積500 μL。將培養(yǎng)板移入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，換用0.5% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細(xì)胞同步化，24 h后吸棄培養(yǎng)液，分別加入不同條件培養(yǎng)液500 μL，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每3 d換液1次。分別于6 d、12 d、18 d后，取誘導(dǎo)后的培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，離心10 min(3 000 r/min)，棄上清液，加PBS溶液500 μL，用移液槍反復(fù)吹打至液體內(nèi)無細(xì)胞團(tuán)塊。再用PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106/mL左右，-20 ℃反復(fù)凍融3次, 使細(xì)胞破壞并釋放出細(xì)胞內(nèi)成分, 待細(xì)胞充分破碎, 制成懸液。將細(xì)胞懸液移入1.5 mL離心管中，離心20 min(3 000 r/min)，仔細(xì)收集上清，-20 ℃凍存，備用。采用ELISA法對(duì)細(xì)胞內(nèi)ALP、BMP-2、BGP蛋白酶體活性進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)步驟見試劑盒說明書。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理, 多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示, P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同規(guī)格鹿茸含藥血清對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖的影響

由表1可知，不同規(guī)格鹿茸藥材含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)BMSCs增殖均有促進(jìn)作用，并且其促進(jìn)作用與時(shí)間相關(guān)，含不同鹿茸血清培養(yǎng)液干預(yù)48 h后, 與空白組比較, 各組A值均顯著升高(P＜0.01)。梅花鹿二杠蠟片組、梅花鹿三岔蠟片組、馬鹿蓮花蠟片組A值均顯著高于誘導(dǎo)液組(P＜0.01)，鹿茸臘片對(duì)BMSCs增殖影響最為顯著。

2.2 鹿茸對(duì)BMSCs成骨分化的影響

與空白組比較，不同品質(zhì)鹿茸藥材含藥血清組與誘導(dǎo)液組BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，ALP、BGP、BMP-2表達(dá)均有所增加(表2～4)。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)ALP表達(dá)量呈先增多、后減少的趨勢(shì); BMP-2表達(dá)量表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢(shì); BGP表達(dá)未現(xiàn)明顯規(guī)律。

2.3 對(duì)不同規(guī)格鹿茸進(jìn)行PCA

2.3.1 數(shù)據(jù)篩選 MTT法檢測(cè)的A值表示細(xì)胞增殖情況，ALP、BGP、BMP-2是成骨細(xì)胞特異性的檢測(cè)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)以48 h細(xì)胞增殖及12 d的ALP、BGP、BMP-2檢測(cè)結(jié)果值影響因素進(jìn)行PCA(表5,6)。

表1 鹿茸含藥血清對(duì)BMSCs增殖的影響

表2 鹿茸含藥血清對(duì)BMSCs成骨分化過程中ALP活性的影響 U/L

表3 鹿茸含藥血清對(duì)BMSCs成骨分化過程中BGP活性的影響 μg/L

表4 鹿茸含藥血清對(duì)BMSCs成骨分化過程中BMP-2活性的影響 μg/L

表5 BMSCS相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3.2 數(shù)據(jù)的處理 化學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)采用Excel 2007,數(shù)據(jù)含量差異較大, 分析前先將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理, 以消除由原始變量的量綱的不同和數(shù)據(jù)差異過大而對(duì)結(jié)果的影響, 使標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)具有可比性, 然后使用SPSS16.0軟件進(jìn)行主成分, MassLynxV4.1軟件繪制主成分得分圖。

2.3.3 PCA結(jié)果 通過MassLynxV4.1軟件繪制A值和ALP值通過降維后不同規(guī)格鹿茸樣本在二維空間的分布聚類情況，結(jié)果見圖1，圖中橫坐標(biāo)表示每個(gè)樣本的第一主成分得分值。縱坐標(biāo)表示每個(gè)樣本的第二主成分得分值。

表6 BMSCS相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)規(guī)范化結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以含10%大鼠鹿茸血清的培養(yǎng)液對(duì)BMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)BMSCs細(xì)胞增殖情況，結(jié)果表明鹿茸有促進(jìn)BMSCs增殖的作用，不同品質(zhì)鹿茸藥材促進(jìn)BMSCs增殖作用不同，培養(yǎng)48 h，作用最為顯著，鹿茸蠟片作用優(yōu)于成骨誘導(dǎo)液。

圖1 不同規(guī)格鹿茸第一第二主成分得分分布

ALP活性的提高是BMSCs向成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志，常用細(xì)胞中該酶的活性高低來檢測(cè)成骨細(xì)胞的存在和成骨細(xì)胞的分化成熟程度[2～4]。BGP反映成骨細(xì)胞活性的主要指標(biāo)，在骨礦化峰期之后才出現(xiàn)積聚,是成骨細(xì)胞分化晚期的標(biāo)志物[5-7]。BMP-2促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化作用最為顯著[8～10]。鹿茸含藥血清可促進(jìn)BMSCs成骨分化過程中ALP、BGP、BMP-2蛋白的分泌，且不同品質(zhì)鹿茸中，蠟片促進(jìn)BMSCs成骨分化的能力明顯高于成骨誘導(dǎo)液，但鹿茸對(duì)ALP、BGP、BMP-2影響并不與其品質(zhì)成簡(jiǎn)單的線性相關(guān)。鹿茸頭茬臘片對(duì)ALP影響顯著，梅花鹿茸二杠二茬蠟片與梅花鹿茸三岔蠟片對(duì)BGP影響顯著，梅花鹿二杠臘片對(duì)BMP-2影響顯著。

以不同規(guī)格鹿茸含藥血清作用于BMSCs的相關(guān)指標(biāo)為變量，使用SPSS16.0軟件進(jìn)行PCA，從主成分得分圖可以看出，鹿茸蠟片和鹿茸白片、血片樣本分散于第一第二空間中，即梅花鹿茸和馬鹿茸蠟片部分分布存在交叉，這與其A值及ALP值相關(guān)，A值及ALP值越接近，其在主成分圖上的重疊率越高。沒有明顯的分組現(xiàn)象。通過A值及ALP值作為分析變量在一定程度上表明了樣本之間的親緣關(guān)系。判別分析結(jié)果表明，鹿茸蠟片全判為1類，鹿茸骨片、血片全判為2類，判別符合率為100%，判別模型效果較好。