李 心,張永春,姜紅紅,孫 翊,李青竹,楊柳燕

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所,上海201403)

朱頂紅為石蒜科朱頂紅屬(HippeastrumHerb.)多年生球根花卉,是本屬原生種和現(xiàn)代改良園藝雜交種的總稱[1-2]。朱頂紅原產(chǎn)于南美洲,17世紀(jì)傳入歐洲和北美,20世紀(jì)初引入中國,目前全球約有75個(gè)原生種和超過600個(gè)園藝品種[3-4]。朱頂紅花大色艷,形態(tài)優(yōu)美,觀賞價(jià)值極高,不僅可以作為重要的盆栽和切花材料,還可以作為露地景觀栽植,具有極其廣泛的應(yīng)用價(jià)值[5]。

植物細(xì)胞染色體的觀察與分析技術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)一項(xiàng)基本技術(shù),多被應(yīng)用于染色體核型分析[6-7]、倍性鑒定[8-9]等生物學(xué)領(lǐng)域。針對染色體形態(tài)進(jìn)行的核型分析有助于了解生物的遺傳物質(zhì)組成、變異規(guī)律、物種起源、進(jìn)化關(guān)系等,在細(xì)胞分類學(xué)、染色體工程、品種間親緣關(guān)系鑒定中具有重要地位[10]。依據(jù)染色體計(jì)數(shù)進(jìn)行的倍性鑒定方法是目前最直接、最可靠、應(yīng)用最廣泛的鑒定方法,在輔助植物雜交育種研究和植物遺傳學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[11]。

迄今為止,國內(nèi)外鮮見關(guān)于朱頂紅染色體制片技術(shù)及核型分析的報(bào)道。1994年,鄒琦麗等[12]通過對朱頂紅原生種‘線縞華胄’(H.rutilum)的染色體核型分析,發(fā)現(xiàn)其染色體數(shù)目為33條,核型公式為K(2n)=3x=33=12 m+9 sm+12 st,被鑒定為三倍體朱頂紅。2013年,陳瑞嬌[13]通過0.1%秋水仙素溶液預(yù)處理朱頂紅根尖進(jìn)行常規(guī)壓片,對白肋朱頂紅(H.reticulatumvar.striatifolium)進(jìn)行染色體制片,核型分析結(jié)果表明,白肋朱頂紅的染色體數(shù)目為22條,核型公式為K(2n)=2x=8 m+6 sm+8 st,核型不對稱系數(shù)(As.K)為69.96%,核型類型為3B型,被鑒定為二倍體朱頂紅。

本試驗(yàn)以朱頂紅新生根尖為材料,通過低溫與8-羥基喹啉水溶液相結(jié)合的預(yù)處理方法和HCl解離對朱頂紅的染色體制片技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究,并首次對朱頂紅園藝品種‘檸檬冰糕’(‘Lemon Sorbet’)進(jìn)行了染色體核型分析。同時(shí),依據(jù)染色體計(jì)數(shù)結(jié)果對6個(gè)朱頂紅商業(yè)品種‘鳳蝶’(H.papilio)、‘特倫蒂諾’(‘Trentino’)、‘粉色驚奇’(‘Pink Surprise’)、‘快車’(‘Rapido’)、‘蘋果花’(‘Apple Blossom’)、‘櫻桃妮芙’(‘Cherry Nymph’)細(xì)胞水平進(jìn)行倍性鑒定,以期為朱頂紅屬資源多樣性研究、新品種選育、親本選配等奠定細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

取9℃冷藏處理后的朱頂紅開花球,于2015年12月種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉基地塑料大棚中,待長出新根后,取新根用于染色體制片。

1.2 方法

切取朱頂紅品種‘檸檬冰糕’新生根尖1 cm左右為試驗(yàn)材料,取樣時(shí)間為上午9：00—10：00;4℃條件下,用0.002 mol∕L 的8-羥基喹啉水溶液對根尖材料分別進(jìn)行不同時(shí)間(1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h)的預(yù)處理;預(yù)處理后的根尖用蒸餾水清洗后置于卡諾氏固定液中,4℃固定12—24 h;蒸餾水清洗后可暫存于70%酒精中;之后取出根尖用蒸餾水清洗,在60℃條件下用1 mol∕L HCl水溶液進(jìn)行解離處理,時(shí)間分別為6 min、9 min、12 min;清洗后在蒸餾水中低滲30 min;用刀片切除根冠后,再切取1 mm根尖于載玻片上,搗碎后滴加卡寶品紅染色液染色10—20 min;常規(guī)壓片后鏡檢并于100倍油鏡下拍照。探索到合適的條件后,以同樣的方法對‘鳳蝶’‘特倫蒂諾’‘粉色驚奇’‘快車’‘蘋果花’‘櫻桃妮芙’進(jìn)行染色體制片。

根據(jù)染色體制片結(jié)果,對朱頂紅品種‘檸檬冰糕’進(jìn)行核型分析,并通過染色體計(jì)數(shù)對‘鳳蝶’‘特倫蒂諾’‘粉色驚奇’‘快車’‘蘋果花’‘櫻桃妮芙’進(jìn)行倍性鑒定。

核型分析根據(jù)李懋學(xué)等[14]制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,使用ImageJ圖像處理軟件進(jìn)行染色體配對、排列、測量等。染色體類型分類根據(jù)Levan等[15]的方法進(jìn)行,核型不對稱系數(shù)采用Arano[16]的方法計(jì)算。核型類型根據(jù)Stebbins[17]的方法劃分。相關(guān)公式為：

臂比(L∕S)=長臂(L)∕短臂(S);

染色體相對長度=染色體長度∕染色體組總長度×100%;

核型不對稱系數(shù)(As.K)=長臂總長∕染色體組總長度×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體制片

2.1.1 預(yù)處理時(shí)間

隨著0.002 mol∕L 8-羥基喹啉水溶液預(yù)處理時(shí)間的增加,染色體逐漸縮短,細(xì)胞質(zhì)濃度逐漸降低,染色體分散程度越來越好(圖1)。其中1 h、3 h、6 h預(yù)處理后,染色體雖漸漸縮短,但仍然未濃縮到一定程度,相互纏繞現(xiàn)象嚴(yán)重;而9 h、12 h、24 h預(yù)處理后,染色體縮短程度基本相差不明顯,且分散程度良好,結(jié)構(gòu)清晰,因此在朱頂紅染色體制片中,選用9—24 h預(yù)處理時(shí)間較為合適。

2.1.2 解離時(shí)間

使用1 mol∕L的HCl溶液解離6 min后,細(xì)胞分散效果良好,染色清晰,但染色體酸解程度不夠,相互纏繞現(xiàn)象嚴(yán)重,無法進(jìn)行染色體相關(guān)分析;解離12 min后,細(xì)胞分散較好,但染色體過度酸解,結(jié)構(gòu)已受到破壞,著色較淡,同樣無法進(jìn)行分析;而9 min的解離時(shí)間相對適宜,細(xì)胞分散良好,染色體酸解適當(dāng),著色良好,結(jié)構(gòu)清晰(圖2)。

圖1 不同預(yù)處理時(shí)間下的染色體形態(tài)Fig.1 Chromosome morphology under different pretreatment time

圖2 不同解離時(shí)間下的染色體形態(tài)Fig.2 Chromosome morphology under different dissociation time

2.2 核型分析

在‘檸檬冰糕’染色體制片圖中,選擇30個(gè)染色體分散良好的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),所有染色體數(shù)目均為33條,占計(jì)數(shù)細(xì)胞的比例為100%,因而確定‘檸檬冰糕’的染色體數(shù)目為2n=33。選擇染色體形態(tài)清晰、分散較好的分裂相進(jìn)行染色體長短臂測量,根據(jù)染色體長度由長至短進(jìn)行配對、排列和編號(表1、圖3—5)。

表1 ‘檸檬冰糕’染色體參數(shù)Table 1 Chromosome parameters of‘Lemon Sorbet’

根據(jù)配對結(jié)果確定‘檸檬冰糕’為三倍體朱頂紅品種,其染色體數(shù)目為2n=3x=33,具有3個(gè)染色體組,染色體基數(shù)為11。

核型分析結(jié)果表明,‘檸檬冰糕’核型公式為K(2n)=3x=33=12m+12sm+9st。其中1、2、3、4號為近中部著絲粒染色體(sm);5、6、7號為近端部著絲粒染色體(st);8、9、10、11號為中部著絲粒染色體(m)。染色體的相對長度變化范圍為5.50%—12.60%,臂比的變化范圍為1.13—3.85,最長染色體與最短染色體長度比為2.29。核型不對稱系數(shù)(As.K)為70.19%。臂比大于2∶1的染色體所占比例為63.64%,根據(jù)Stebbins的核型分類標(biāo)準(zhǔn),‘檸檬冰糕’核型類型為3B型。

圖3 ‘檸檬冰糕’染色體形態(tài)Fig.3 Chromosome morphology of‘Lemon Sorbet’

圖4 ‘檸檬冰糕’染色體核型Fig.4 Chromosome karyotype of‘Lemon Sorbet’

圖5 ‘檸檬冰糕’染色體核型模式圖Fig.5 Chromosome karyotype pattern of‘Lemon Sorbet’

2.3 倍性鑒定

6個(gè)朱頂紅園藝品種的染色體制片結(jié)果表明：‘鳳蝶’染色體計(jì)數(shù)為22條;‘特倫蒂諾’染色體計(jì)數(shù)為33條;‘粉色驚奇’‘快車’‘蘋果花’‘櫻桃妮芙’染色體計(jì)數(shù)均為44條(圖6)。因朱頂紅品種染色體基數(shù)為11,故‘鳳蝶’染色體數(shù)目為2n=2x=22,具有兩個(gè)染色體組,為二倍體朱頂紅;‘特倫蒂諾’染色體數(shù)目為2n=3x=33,具有三個(gè)染色體組,為三倍體朱頂紅;‘粉色驚奇’‘快車’‘蘋果花’‘櫻桃妮芙’染色體數(shù)目為2n=4x=44,具有四個(gè)染色體組,均為四倍體朱頂紅。

圖6 不同朱頂紅品種的染色體形態(tài)Fig.6 The chromosome morphology of different Hippeastrum cultivars

3 討論

染色體制片技術(shù)環(huán)節(jié)主要包括：取材時(shí)間與部位、預(yù)處理方法、固定時(shí)間、解離試劑與時(shí)間、低滲時(shí)間等[18]。其中預(yù)處理的主要作用是阻斷紡錘體形成、提高中期分裂相頻率、促進(jìn)染色體縮短、改變胞質(zhì)粘度等。目前常用的化學(xué)處理試劑為8-羥基喹啉、秋水仙素、飽和對二氯苯和α-溴萘,藜蘆堿、風(fēng)油精、放線菌酮等也有少量研究者使用[19]。物理處理方法主要是0—8℃低溫處理[20]。朱頂紅的核型分析中,鄒琦麗等[12]并未提及研究中所用的預(yù)處理方法,陳瑞嬌[13]采用的是秋水仙素預(yù)處理朱頂紅根尖的方法。本研究首次使用了8-羥基喹啉與低溫處理相結(jié)合的方法,其試劑毒性相對秋水仙素較小,獲得的染色體形態(tài)分散良好、縮短長度適宜、縊痕明顯,可以在朱頂紅染色體制片研究中推廣應(yīng)用。解離的作用是促進(jìn)細(xì)胞分散和染色體分離。酶解主要使用的試劑是纖維素酶與果膠酶,費(fèi)用相對昂貴,溫度在25—37℃,時(shí)間一般在1—4 h[6]。酸解一般使用的試劑為鹽酸,費(fèi)用低廉,溫度為60℃,時(shí)間一般為5—20 min[7,20]。由此可知,酸解是一種比較高效低廉的解離手段,本研究和陳瑞嬌[13]均采用了酸解的方法,效果非常理想,因而在朱頂紅制片中應(yīng)優(yōu)先采用。

本研究認(rèn)為朱頂紅品種‘檸檬冰糕’的核型公式為K(2n)=3x=33=12 m+12 sm+9 st,其中1、2、3、4號染色體類型為sm,5、6、7號染色體類型為st,8、9、10、11號染色體類型為m。鄒琦麗等[12]和陳瑞嬌[13]分別對朱頂紅原生種‘線縞華胄’和白肋朱頂紅進(jìn)行了核型分析,其核型公式分別為K(2n)=3x=33=12 m+9 sm+12 st和 K(2n)=2x=8 m+6 sm+8 st,其中 1、2、3 號染色體類型為 sm,4、5、6、7 號染色體類型為st,8、9、10、11號染色體類型為m。本研究和前人研究結(jié)果基本一致,唯一的分歧在于4號染色體類型。前人的研究中4號染色體臂比值為3.06—3.07,而本研究中4號染色體臂比值為2.85,比值相差并不大,因而這種差異很有可能是染色體測量誤差導(dǎo)致。綜合這3次核型分析結(jié)果來看,朱頂紅核型不對稱系數(shù)(As.K)分別為72.59%、69.96%、70.19%,核型類型均為3B型。在生物進(jìn)化過程中,染色體核型不對稱程度越高,其進(jìn)化程度也越高[17],因此朱頂紅應(yīng)該是植物演化史中進(jìn)化程度較高的物種。另外,這3個(gè)朱頂紅品種染色體基數(shù)均為11,核型也基本一致,說明朱頂紅屬植物在親緣關(guān)系上較為接近,這與朱頂紅大部分原生種可以輕易雜交這一現(xiàn)象也比較一致。

本研究還對6個(gè)朱頂紅品種‘鳳蝶’‘特倫蒂諾’‘粉色驚奇’‘快車’‘蘋果花’‘櫻桃妮芙’進(jìn)行了倍性鑒定?！P蝶’原產(chǎn)巴西,是1970發(fā)現(xiàn)的原生種;‘特倫蒂諾’為南非園藝品種,于2007年育成;‘粉色驚奇’‘快車’‘蘋果花’‘櫻桃妮芙’是荷蘭育種家分別于2005年、2001年、1954年和2004年培育成的園藝品種。研究結(jié)果表明：‘鳳蝶’為二倍體,‘特倫蒂諾’為三倍體,‘粉色驚奇’‘快車’‘蘋果花’和‘櫻桃妮芙’均為四倍體?；ò晷螒B(tài)數(shù)據(jù)表明,‘粉色驚奇’‘快車’‘蘋果花’和‘櫻桃妮芙’相比‘鳳蝶’‘特倫蒂諾’花徑更大(未發(fā)表),觀賞性狀更為優(yōu)良。說明朱頂紅多倍體育種在觀賞性方面改進(jìn)較大,具有較為重要的意義。另外,雜交育種在朱頂紅育種工作中占有重要地位,在近年來國內(nèi)外育種家的共同努力下,朱頂紅園藝品種越來越多,而對這些來源不同的品種進(jìn)行的系統(tǒng)性歸納和研究并不多。本研究對其中1個(gè)原生種和5個(gè)園藝品種在染色體水平上進(jìn)行了倍性鑒定,為雜交育種和倍性育種工作的開展提供了細(xì)胞遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)。