王曉霞 劉天龍 劉晶 劉小玲 張勇 肖云峰 劉小雷

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）09-1189-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.09

摘 要 目的：研究黃芪甲苷對(duì)D-半乳糖（D-gal）誘導(dǎo)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：分離和培養(yǎng)Wistar乳鼠原代心肌細(xì)胞，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（無血清DMEM高糖培養(yǎng)基）、D-gal組（含5 g/L D-gal的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基）和黃芪甲苷低、中、高質(zhì)量濃度組（分別先以含25、50、100 ?g/mL黃芪甲苷的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，然后換為含有相應(yīng)質(zhì)量濃度黃芪甲苷和5 g/L D-gal的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基）。采用CCK-8法檢測培養(yǎng)48 h后細(xì)胞活性，分別采用Hoechst染色法（培養(yǎng)24 h）和流式細(xì)胞術(shù)（培養(yǎng)48 h）考察細(xì)胞凋亡情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測培養(yǎng)24 h后細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子（Bcl-2、Bax、Caspase-3）和心房鈉尿肽（ANP） mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，D-gal組細(xì)胞的活性以及細(xì)胞中Bcl-2 mRNA水平、Bcl-2/Bax比值降低，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Bax、Caspase-3、ANP mRNA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與D-gal組比較，黃芪甲苷各濃度組細(xì)胞的活性以及細(xì)胞中Bcl-2 mRNA水平、Bcl-2/Bax比值均升高，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Bax、Caspase-3、ANP mRNA水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且具有一定濃度依賴性。結(jié)論：黃芪甲苷對(duì)D-gal誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與升高細(xì)胞中Bcl-2/Bax比值和下調(diào)細(xì)胞中Caspase-3、ANP mRNA的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃芪甲苷；D-半乳糖；原代心肌細(xì)胞；凋亡；保護(hù)作用

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effect and mechanism of astragaloside Ⅳ on D-galactose （D-gal）-induced primary cardiomyocytes apoptosis. METHODS： Wistar neonatal rat primary cardiomyocytes were isolated and cultured. The cardiomyocytes were divided into normal control group （DMEM high glucose medium without serum）， D-gal group （DMEM high glucose medium without serum containing 5 g/L D-gal） and astragaloside Ⅳ low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （after cultured with DMEM high glucose medium without serum containing 25， 50， 100 ?g/mL astragaloside Ⅳ for 1 h， and then replaced with DMEM high glucose medium without serum containing corresponding concentration of astragaloside Ⅳ and 5 g/L D-gal）. Cardiomyocytes activity was detected by CCK-8 kit after cultured for 48 h. The apoptosis level was detected by Hoechst staining （cultured for 24 h） and flow cytometry （cultured for 48 h）. The mRNA expressions of apoptosis related factors （Bcl-2， Bax， Caspase-3） and ANP in cardiomyocytes were detected by RT-PCR after cultured for 24 h. RESULTS： Compared with normal control group， the activity of cardiomyocytes， mRNA level of Bcl-2 and ratio of Bcl-2/Bax were decreased in D-gal group， while apoptosis rate and mRNA levels of Bax， Caspase-3 and ANP were increased， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. Compared with D-gal group， the activity of cardiomyocytes， mRNA level of Bcl-2 and ratio of Bcl-2/Bax were increased in astragaloside Ⅳ groups， while apoptosis rate and mRNA levels of Bax， Caspase-3 and ANP were decreased， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）， and in concentration-dependent manner. CONCLUSIONS： Astragaloside Ⅳ can protect D-gal induced primary cardiomyocytes from apoptosis， the mechanism of which may be associated with the increase of Bcl-2/Bax ratio and the decrease of mRNA expressions of Caspase-3 and ANP.

KEYWORDS Astragaloside Ⅳ； D-galactose； Primary cardiomyocytes； Apoptosis； Protective effect

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是中蒙醫(yī)臨床處方中較重要的藥材，而黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ）是黃芪的主要有效成分之一[1]。黃芪皂苷在心血管疾病的治療中具有較大的應(yīng)用潛力，有研究顯示，其能夠通過提高心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、抑制環(huán)磷腺苷水解、抗氧化應(yīng)激及調(diào)節(jié)血壓和脂質(zhì)代謝等方式對(duì)多種原因引起的心肌損傷、心力衰竭及生理性衰老等具有一定保護(hù)作用[2]。但上述研究多使用的是黃芪總皂苷，而對(duì)于黃芪皂苷單體的生物學(xué)活性研究報(bào)道較少。

凋亡在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要的作用，在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚、心肌梗死及心力衰竭等病理改變中均涉及心肌細(xì)胞的凋亡[3]。而且，在動(dòng)物水平上通過藥物刺激、基因敲除或基因過表達(dá)等手段抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)壓力誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)和心力衰竭具有很好的保護(hù)作用[4]。鑒于此，本研究以蒙古黃芪提取物——黃芪甲苷為研究對(duì)象，考察其對(duì)D-半乳糖（D-galactose，簡寫為D-gal）誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用并探討其可能的作用機(jī)制，這不僅是從天然產(chǎn)物中開發(fā)治療心血管疾病特異性藥物的基礎(chǔ)，而且對(duì)于開發(fā)內(nèi)蒙古地區(qū)特色的中蒙藥資源有著重要的意義。

1 材料

1.1 儀器

RC低溫離心機(jī)（美國Sorvall公司）；JB-3電磁攪拌器（上海雷磁儀器廠）；Z360K高速冷凍離心機(jī)（德國Hermle公司）；Model550酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；Eclipse生物倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（美國Thermos公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪甲苷（本課題組提取，批號(hào)：20170106，純度：經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜鑒定>98%）；CCK-8染色試劑盒（同仁化學(xué)研究所）； 熒光素FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ（FITC-Annexin Ⅴ）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；Hoechst 33342染色試劑（美國R&D公司）；Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）；凋亡相關(guān)因子（Bcl-2、Bax、Caspase-3）、心房鈉尿肽（ANP）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物均由北京奧科生物技術(shù)有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

原代心肌細(xì)胞由本課題組依據(jù)文獻(xiàn)[5]從新生大鼠[購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（蒙）2016-0001]心臟中分離和培養(yǎng)。

2 方法

2.1 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

將原代心肌細(xì)胞差速貼壁后對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)，以細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL分別接種于6、12、96孔板中，接種的量分別是2 mL、1 mL和100 μL，接種的細(xì)胞均使用含10%胎牛血清（FBS）、2×青鏈霉素混合液及2%的5-溴脫氧尿嘧啶核苷的DMEN高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，使用無血清的培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24 h，然后用α-輔肌動(dòng)蛋白（α-actinin）抗體對(duì)原代心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，對(duì)其純度進(jìn)行鑒定。采用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)學(xué)變化，并拍照記錄。

2.2 黃芪甲苷對(duì)D-gal誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞活性改變的影響

將細(xì)胞接種在96孔板中，加入無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，棄去培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、D-gal組和黃芪甲苷低、中、高質(zhì)量濃度組，每組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組細(xì)胞加入100 ?L無血清的培養(yǎng)基；D-gal組細(xì)胞加入含5 g/L D-gal的無血清培養(yǎng)基100 ?L[6]；黃芪甲苷低、中、高質(zhì)量濃度組細(xì)胞先分別加入含25 、50、100 ?g/mL黃芪甲苷的無血清培養(yǎng)基100 ?L，作用1 h，然后更換為含相應(yīng)黃芪甲苷濃度和5 g/L D-gal的無血清培養(yǎng)基。各組細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入含有10% CCK-8試劑的無血清培養(yǎng)基100 ?L，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的吸光度值。

2.3 黃芪甲苷對(duì)D-gal誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 Hoechst 33342染色法 將細(xì)胞接種于12孔板中，加入無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，然后按“2.2”項(xiàng)下分組處理，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細(xì)胞1次，4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min，棄去固定液，用PBS洗細(xì)胞2次，每次3 min，吸棄PBS，每孔加入0.25 mL Hoechst 33342染色液，混勻，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30 min，棄染色液，PBS洗細(xì)胞3次，每次3 min，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照。

2.3.2 流式細(xì)胞術(shù) 將細(xì)胞接種于6孔板中，加入無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，然后按“2.2”項(xiàng)下方法分組、給藥，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞1次，胰酶消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，離心去胰酶。使用100 μL結(jié)合緩沖液（Binding buffer）重懸細(xì)胞，加入5 μL的FITC-Annexin Ⅴ和5 μL的PI，避光室溫條件下反應(yīng)15 min后，每個(gè)樣品加入400 μL的Binding buffer，在流式細(xì)胞儀上檢測各組的凋亡細(xì)胞情況。

2.4 黃芪甲苷對(duì)細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、ANP mRNA表達(dá)的影響

按“2.2”項(xiàng)下方法饑餓處理細(xì)胞后分組給藥，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×qPCR SYBR Green Master Mix緩沖液 5 μL，2 μmol/L的上、下游引物各1 μL，cDNA模板3 μL，總體積為10 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；然后以72 ℃延伸5 min結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)束后以GAPDH為內(nèi)參，采用Quante Studio Soft 1.3軟件通過2ΔΔct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列和產(chǎn)物長度見表1。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定結(jié)果

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示，剛分離接種到培養(yǎng)板中的心肌細(xì)胞大多為圓形，偶見少數(shù)其他不規(guī)則形狀；培養(yǎng)4 h后，細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)貼壁狀態(tài)，偶見扁平形、三角形及少數(shù)長梭形；培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞基本貼壁，多呈圓形、梭形和三角形，貼壁的單個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率和節(jié)律還未同步。免疫組化結(jié)果顯示，培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度在95%以上。原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞的鑒定圖見圖1。

3.2 細(xì)胞活性測定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，D-gal組細(xì)胞的活性顯著降低（P<0.01）；與D-gal組比較，黃芪甲苷低、中、高質(zhì)量濃度組細(xì)胞的活性均顯著升高（P<0.01），且具有一定的濃度依賴性。正常對(duì)照組、D-gal組和黃芪甲苷低、中、高質(zhì)量濃度組的細(xì)胞活性分別為100%、（44.75±3.50）%、（58.51±4.54）%、（65.44±3.13）%、（71.88±3.70）%（n=6）。

3.3 細(xì)胞凋亡測定結(jié)果

3.3.1 Hoechst 33342染色結(jié)果 正常對(duì)照組細(xì)胞呈均一的核染，且未見異常核；D-gal組細(xì)胞呈典型凋亡狀態(tài)，鏡下可見染色質(zhì)濃集、核固縮、核碎裂等多種凋亡形態(tài)學(xué)特征，且貼壁細(xì)胞數(shù)量減少明顯；黃芪甲苷低濃度組細(xì)胞可見少數(shù)的核固縮、核碎裂，但貼壁細(xì)胞數(shù)量較D-gal組多；黃芪甲苷中濃度組核固縮、核碎裂的細(xì)胞數(shù)顯著減少；黃芪甲苷高濃度組細(xì)胞狀態(tài)與正常對(duì)照組細(xì)胞接近，并且貼壁細(xì)胞數(shù)較D-gal組明顯多。各組細(xì)胞凋亡檢測的Hoechst 33342染色圖見圖2。

3.3.2 流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，D-gal組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01）；與D-gal組比較，黃芪甲苷低、中、高質(zhì)量濃度組的細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P<0.01），且具有一定的濃度依賴性。各組細(xì)胞凋亡率測定的流式圖見圖3，測定結(jié)果見表2。

3.4 細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、ANP mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，D-gal組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平和Bcl-2/Bax比值顯著降低（P<0.05），Bax、Caspase-3、ANP mRNA的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與D-gal組比較，黃芪甲苷低、中、高質(zhì)量濃度組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平和Bcl-2/Bax比值均顯著升高（P<0.05），Bax、Caspase-3、ANP mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3和ANP mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果見表3。

4 討論

D-gal是一種常用的衰老誘導(dǎo)劑，在篩選與衰老相關(guān)的致病靶點(diǎn)和相關(guān)藥物的研究中應(yīng)用廣泛，D-gal誘導(dǎo)的體內(nèi)外衰老表型主要與氧化應(yīng)激、自噬或凋亡相關(guān)的細(xì)胞損傷及與線粒體功能障礙相關(guān)的代謝異常有關(guān)[7]。在D-gal誘導(dǎo)的衰老過程中涉及Caspase-3依賴的凋亡途徑。研究顯示，活化的Caspase-3能夠裂解很多底物蛋白（如PARP），被裂解的PARP失去固有生物活性的同時(shí)損傷細(xì)胞核內(nèi)的DNA，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[8]。在本研究中，D-gal組細(xì)胞中Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平顯著升高，而給予黃芪甲苷后細(xì)胞中Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平顯著降低，提示這是黃芪甲苷抑制D-gal誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。

ANP是一種由心房合成、貯存和分泌的活性多肽，具有強(qiáng)大的利鈉、利尿、舒張血管、降低血壓、對(duì)抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)和抗利尿激素等作用，當(dāng)心臟壓力負(fù)荷和容量負(fù)荷增加時(shí)，心房會(huì)反射性地合成和分泌ANP，以減輕心臟負(fù)荷和改善心功能[9-10]。因此，ANP常作為判斷心功能是否受損的標(biāo)志。在本研究中，與正常對(duì)照組細(xì)胞比較，D-gal能夠提高細(xì)胞中ANP mRNA的表達(dá)水平，而給予不同濃度黃芪甲苷后細(xì)胞中ANP mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，這提示黃芪甲苷對(duì)D-gal所致的細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用。

有研究顯示，細(xì)胞或機(jī)體在應(yīng)激條件下自噬過程的活化在一定程度上會(huì)減少或抑制凋亡過程，如敲除或敲低與自噬過程相關(guān)的基因ATG后通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[11-12] 。Bcl-2是一類抗凋亡蛋白，其通過結(jié)合或抑制自噬調(diào)節(jié)蛋白Beclin1的活性而對(duì)自噬過程發(fā)揮間接的負(fù)調(diào)節(jié)作用[13]。相反，Bcl-2家族成員Bax是一種促凋亡因子，其能夠通過Caspase通路裂解自噬調(diào)節(jié)蛋白Beclin1而阻止自噬過程的發(fā)生[14]。因此，Bcl-2和Bax表達(dá)水平的比值能夠反映細(xì)胞凋亡和自噬水平。在本研究中，D-gal組細(xì)胞中Bcl-2/Bax比值顯著降低，說明細(xì)胞的凋亡水平較高；給予黃芪甲苷后細(xì)胞中Bcl-2/Bax比值顯著升高，說明細(xì)胞中具有抑制凋亡作用的Bcl-2水平增加，而具有促凋亡作用的Bax水平降低，該結(jié)果在相應(yīng)的Hoechst熒光染色和流式細(xì)胞儀凋亡分析中也得到了驗(yàn)證。

綜上所述，黃芪甲苷對(duì)D-gal誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制ANP、Caspase-3 mRNA的表達(dá)和提高Bcl-2/Bax的比值有關(guān)，但其更多的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-10-23 修回日期：2018-02-28）

（編輯：林 靜）