陳琛　羅俊杰　王煒

摘要：為了解小孢子發(fā)育時期與花蕾外部形態(tài)特征的相互關(guān)系，選用2個胡麻品種為試驗材料，用改良苯酚品紅溶液壓片法將5月中旬蕾長為3～8 mm的花蕾制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察了小孢子發(fā)育情況，以分析胡麻小孢子發(fā)育時期與花蕾大小之間的關(guān)系。結(jié)果表明，當花蕾長度為3～4 mm時，小孢子發(fā)育基本處在四分體時期； 4～5 mm時，小孢子大部分處于單核中期；5～6 mm時，花藥中存在各種發(fā)育時期的小孢子，但以單核靠邊期為主；當蕾長 > 6 mm時，小孢子開始大量成熟，直至發(fā)育為成熟花粉。品種間有差異，但差異較小，基本趨勢一致。

關(guān)鍵詞：胡麻；小孢子；花藥培養(yǎng)；染色

中圖分類號：S565.9 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）07-0021-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.07.007

Abstract：The study aimed at investigation of the relationship between microspore development period and the morphology of bud of Linum usitatissimum L.. Two cultivars of Linum usitatissimum L. were used as experiment materials， and buds were picked in mid-May， with length between 3～8 mm. The development of microspore was observed under optical microscope， and the relationship between the microspore developmental stages of Linum usitatissimum and the size of buds was analyzed. The results showed that when the buds' length was 3～4 mm， the microspore development was basically in tetrad. When the buds' length was 4～5 mm， the microspores developed into mid-uninucleate. When the buds' length was 5～6 mm， various kinds of developmental stages of microspores could be observed， but most of them were late-uninucleate microspores. When the buds' length exceeded 6 mm， a big scale of microspores entered mature period and turned into pollens. The results in two cultivars were basically consistent， with tiny differences which were not significant.

Key words： Linum usitatissimum L. ；Microspore；Anther culture；Staining

胡麻，即油用亞麻，屬亞麻科、亞麻屬一年生草本作物，是中國西北、華北和黃土高原等旱作農(nóng)業(yè)地區(qū)重要的油料作物之一。我國胡麻育種研究距今已有60余年歷史，所用的育種方法有雜交育種、組織培養(yǎng)、分子育種、物理/化學(xué)誘變育種等[1 ]。

花藥培養(yǎng)作為單倍體育種中應(yīng)用最成功的方法，能大幅度縮短育種年限、提高育種效率、快速選育新品種。亞麻花藥培養(yǎng)的研究始于20世紀70年代，由我國首次培育出亞麻花粉植物[2 ]。植物花藥培養(yǎng)過程中，有很多因素對單倍體的誘導(dǎo)效果產(chǎn)生影響，如基因型、花粉發(fā)育時期、脅迫處理、激素、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等[3 ]，只有發(fā)育到一定時期的花粉才對離體刺激最敏感，并最終發(fā)育成完整植株。因此選擇適宜的花粉發(fā)育時期對于花藥培養(yǎng)成功與否有決定性的作用[4 ]。但是，在大量的花藥和小孢子培養(yǎng)過程中，通過顯微鏡逐個觀察取材是很困難和繁瑣的。大量研究證明，小孢子發(fā)育時期與花蕾外部形態(tài)密切相關(guān)。例如，油菜的花粉發(fā)育時期與花蕾長度有直接關(guān)系[5 ]；在紅花槐中，花粉發(fā)育時期與花蕾縱徑，花冠與花萼的長度比等存在相關(guān)性[6 ]；白芷的花粉發(fā)育時期可根據(jù)花藥顏色和花瓣顏色直觀判斷[7 ]。通過花蕾外觀形態(tài)（蕾長、花瓣顏色等）特征快速、準確地選擇適宜的花培材料已被廣泛運用在花藥培養(yǎng)工作中。有關(guān)胡麻花蕾大小與小孢子發(fā)育時期關(guān)系的研究尚未見報道。我們通過對胡麻不同大小花蕾的花藥染色壓片，用顯微鏡觀察計數(shù)并拍照統(tǒng)計，探討花蕾外部形態(tài)特征與小孢子發(fā)育時期的關(guān)系，旨在為胡麻花藥和小孢子培養(yǎng)提供依據(jù)，以提高取材的準確性和效率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為胡麻雜交種隴亞雜1號、隴亞8號，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 采樣與測量 3月底將胡麻種子分別播種于大田和溫室，田間管理采用常規(guī)方法[8 ]。從5月初胡麻花蕾期采樣，每天9：00時～10：00時分別在大田和溫室采集新鮮、大小不同的花蕾，放入自封口塑料袋內(nèi)帶回實驗室。用游標卡尺測量花蕾長度，并按花蕾長度分為五個區(qū)間：3～4 mm，4～5 mm，5～6 mm，6～7 mm，7～8 mm。每個區(qū)間取5個花蕾，重復(fù)3次。用鑷子輕輕剝?nèi)セɡ佥嗥突ò?，取出花藥并用游標卡尺測量長度，記錄數(shù)據(jù)并拍照。

1.2.2 壓片 將花藥置于載玻片上， 分別用醋酸洋紅和改良苯酚品紅兩種染液染色，滴1滴染色液使其完全浸沒，用玻璃棒擠壓花藥使小孢子散落出來，去掉花藥殘渣。染色1.5 min后蓋上蓋玻片，吸去多余染液，在顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育狀況并拍照記錄。染色液采用改良的苯酚品紅溶液，顯微鏡為奧林巴斯BX-51。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色液選擇及染色時間

染色液的選擇和染色時間對于制片是否成功有重要影響，直接關(guān)系到小孢子鏡檢的效果。通過對比醋酸洋紅和改良苯酚品紅2種染液后（圖1）得出，苯酚品紅更適合胡麻游離小孢子染色觀察。經(jīng)醋酸洋紅染色的標本背景較混雜，不易區(qū)分各發(fā)育時期的小孢子。

染色時間不宜過長，容易將所有細胞染成深色不易觀察；染色的時間也不能過短，達不到染色的效果。通過試驗摸索，染色時間以1.5～2.0 min最為適宜。

2.2 小孢子的發(fā)育特征

從圖2可以看出，小孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)第一次分裂形成的二分體（見圖A）。再經(jīng)過減數(shù)第二次分裂形成四分體，呈“田”字形，在顯微鏡下可以看到小孢子被胼胝質(zhì)包裹（見圖B）；之后小孢子從胼胝質(zhì)中游離出來分散在花粉囊中，此時細胞核較大居中，即單核居中期（見圖C）；隨著液泡的逐漸增大，細胞核慢慢向細胞邊緣游移，同時萌發(fā)孔開始形成，直到細胞核移動至細胞邊緣，小孢子具有三個萌發(fā)孔（見圖D、圖E）；小孢子繼續(xù)發(fā)育，細胞核經(jīng)過2次有絲分裂后形成成熟花粉粒，此時在顯微鏡下花粉粒顏色變深，看不到細胞器，細胞膨大呈球形（見圖F）。

2.3 小孢子各個發(fā)育時期與花蕾長度的關(guān)系

小孢子的發(fā)育時期分為四分體時期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期、三核期5個時期。由于試驗條件的限制，雙核花粉期和三核花粉期在顯微鏡下難以區(qū)分，其內(nèi)部特征不是特別明顯，因此將這2個時期并歸為小孢子發(fā)育后期。花藥長度、花藥顏色及花瓣顏色也隨小孢子不同發(fā)育時期而變化。

在顯微鏡下對胡麻雜交種隴亞雜1號不同時期的小孢子進行觀察，結(jié)果見表1?？梢钥闯觯敾ɡ匍L度在3～4 mm時，花蕾中以二分體和四分體小孢子為主，以及少部分散落分布的單核早中期小孢子，此時細胞質(zhì)顏色淺，細胞核易見；隨著花蕾的長度增加，四分體小孢子逐漸減少，單核早中期小孢子數(shù)量增多，并且出現(xiàn)少量單核靠邊期小孢子。當花蕾長度在5～6 mm時，單核靠邊期小孢子數(shù)量急劇增加達到峰值，單核早中期小孢子數(shù)量減少，同時有一定數(shù)量的小孢子進入成熟期?；ɡ匍L度 > 6 mm時，單核早中期和靠邊期小孢子減少至消失，視野內(nèi)以成熟花粉粒為主。

從表2可以看出，隴亞8號小孢子發(fā)育時期與蕾長的關(guān)系趨勢與隴亞雜1號基本一致，但也有部分差別。如四分體小孢子在隴亞雜1號中只在3～4 mm花蕾中大量存在，在4～5 mm的花蕾中鮮見，蕾長至5～6 mm時已經(jīng)觀察不到四分體小孢子。而在隴亞8號中蕾長4～5 mm的花蕾中還以四分體小孢子為主，花蕾長至5 mm之后四分體數(shù)量減少至消失。

從圖3可以看出，隴亞雜1號各個時期的小孢子數(shù)量峰值都分別對應(yīng)不同的蕾長區(qū)間，而隴亞8號中各時期小孢子與蕾長的對應(yīng)關(guān)系不是很分明。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，當花蕾長度為3～4 mm時，小孢子發(fā)育基本處在四分體時期；花蕾4～5 mm大小時，小孢子大部分處于單核中期；5～6 mm蕾長的花藥中主要以單核靠邊期為主；當蕾長 > 6 mm時小孢子開始大量成熟，直至發(fā)育為成熟花粉。花藥長度和花瓣顏色也隨小孢子發(fā)育而產(chǎn)生變化。2個品種間有差異，但差異不大，總體趨勢一致。該結(jié)果有助于進行胡麻花藥和小孢子培養(yǎng)的選蕾時提高取材的準確性和效率。

不同植物花藥培養(yǎng)的最佳取材時期不同，例如，黃瓜和甘藍的最佳培養(yǎng)時期是單核靠邊期[9 - 10 ]，而大豆的最佳培養(yǎng)時期是單核早、中期[11 ]。對大多數(shù)植物而言，單核中晚期是花藥和小孢子培養(yǎng)的最佳取材時期，而四分體時期和成熟期的小孢子都很難誘導(dǎo)愈傷組織和胚狀體。其原因有兩種說法，一是小孢子發(fā)育的單核中期至靠邊期是胚胎形成的臨界期，未到或超過這一發(fā)育階段就難以形成胚狀體；另一種說法認為，小孢子發(fā)育過程中花藥內(nèi)的激素水平在不斷改變，花藥成熟時激素水平不再適宜于它的成熟和分裂[12 - 13 ]。胡麻花藥培養(yǎng)最佳取材時期還未見報道，這需要通過實驗實踐進一步探索。

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（本文責編：楊 杰）