劉鑫

摘 要：主要對大型突變體文庫、全長cDNA文庫兩方面進(jìn)行介紹，并舉例說明對作物遺傳改良有影響的一些進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：水稻；突變體文庫；全長cDNA文庫

1 突變體文庫

通過敲除、抑制、過表達(dá)和異位表達(dá)，從而改變基因的表達(dá)水平或模式，這是破譯基因功能的常用策略之一。因此，構(gòu)建飽和突變體文庫對于基因功能的鑒定是必不可少的。目前，不同國家的許多實驗室已經(jīng)利用多種策略（包括T-DNA、轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入）開發(fā)了突變體文庫，其材料和相關(guān)數(shù)據(jù)正在迅速積累當(dāng)中。

除了敲除或抑制基因的表達(dá)外，這種文庫還可用于揭示標(biāo)記基因的表達(dá)模式。T-DNA和轉(zhuǎn)座子可通過添加功能元件，如激活標(biāo)簽、基因捕獲標(biāo)簽、啟動子捕獲標(biāo)簽和增強(qiáng)子捕獲標(biāo)簽等進(jìn)行修飾。例如，Wu等人[1]采用了3種水稻基因組功能分析策略構(gòu)建了突變體文庫，其中包括插入誘變、增強(qiáng)子誘捕和異位表達(dá)。插入誘變是突變體文庫的共同特征。許多增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)已經(jīng)使用了GAL4-VP16元件，當(dāng)T-DNA插入增強(qiáng)子附近時，GAL4-VP16將被表達(dá)，并且GAL4-VP16將與UAS結(jié)合，促使報道基因GUS或GFP的轉(zhuǎn)錄。對于異位表達(dá)，需要產(chǎn)生目標(biāo)系，且靶基因?qū)⒂蒛AS啟動子驅(qū)動表達(dá)。當(dāng)模式系與效應(yīng)系雜交時，GAL4-VP16可以與UAS結(jié)合，從而指導(dǎo)目的基因的表達(dá)。結(jié)果表明，該系統(tǒng)在異位表達(dá)檢測基因功能方面效果很好。因此，除了插入引起功能缺失突變以外，增強(qiáng)子誘變突變體文庫還可以提供一系列組織特異性表達(dá)株系，用于多種目的[2]。

研究者們[3]投入了大量的工作來分離插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，以提供插入標(biāo)簽（側(cè)翼序列標(biāo)簽，F(xiàn)ST）。使用的手段包括熱不對稱交錯（TAIL）-PCR、反向PCR和銜接頭PCR。盡管T-DNA轉(zhuǎn)化株系總數(shù)很大，然而由于FST序列分離速度緩慢，側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫的完善仍有很長的路要走。

合成、管理、維護(hù)和篩選如此龐大的文庫，其復(fù)雜程度是十分巨大的。此外，T-DNA的非隨機(jī)分布發(fā)生在不同層次的基因組結(jié)構(gòu)上，偏向于大片段染色體而在TE相關(guān)序列插入頻率低，優(yōu)先發(fā)生在基因的5'-上游和3'-下游區(qū)域，且差異出現(xiàn)在某些類別的功能基因中。這種分布模式導(dǎo)致T-DNA插入途徑在獲取某些基因組區(qū)域和恢復(fù)某些類型的基因方面有較大的困難。因此，更有效的替代方法有待繼續(xù)探索。

除T-DNA插入之外，化學(xué)和物理誘變也可以為構(gòu)建飽和突變體文庫提供途徑。如今新的測序技術(shù)提高了識別突變位點(diǎn)的能力，使其可行性大大提升。RNA干擾技術(shù)是另外一個方法，該方法通過人造miRNAs沉默靶基因從而產(chǎn)生缺失突變體，它們多具有組織特異性或可誘導(dǎo)性[4]。這種方法的一個好處是僅僅需要很少的突變株就能獲得基因組的飽和突變。

2 全長cDNA文庫

通過全長cDNA文庫提供的信息，可以鑒定轉(zhuǎn)錄單位、內(nèi)含子、外顯子、可能的啟動子以及預(yù)測的基因產(chǎn)物，從而極大地幫助基因組序列的注釋。此外，全長cDNA文庫可以提供經(jīng)常用于基因分離的基因克隆的目錄，從而節(jié)省相當(dāng)大的工作量，促進(jìn)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

研究工作者們在收集全長cDNA克隆工作中已經(jīng)取得兩個大的進(jìn)展。在粳稻的研究方面，Kikuchi等人[5]通過從粳稻品種日本晴文庫中收集全長cDNA克隆起始了這項工作。目前，已經(jīng)分離出的全長cDNA克隆序列可以通過檢索水稻分子生物學(xué)百科全書數(shù)據(jù)庫獲得。在秈稻工作中，研究人員已經(jīng)從秈稻品種廣陸矮4號和明恢63號中分離出20 000多個全長cDNA克隆，科研人員可以通過搜索秈稻cDNA數(shù)據(jù)庫獲取這些克隆。另外，這些秈稻、粳稻和野生稻的全長cDNA克隆也為比較基因組學(xué)的發(fā)展提供了重要資源。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] Wu C，Li X，Yuan W，et al. Development of enhancer trap lines

for functional analysis of the rice genome[J]. The Plant Journal，

2003，35（03）： 418-427.

[ 2 ] Liang D，Wu C，Li C，et al. Establishment of a patterned GAL4-VP16

transactivation system for discovering gene function in rice[J].

The Plant Journal，2006，46（06）：1 059-1 072.

[ 3 ] Zhang J，Guo D，Chang Y，et al. Non-random distribution of T-

DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed

by analyzing 13 804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-

trap mutant library[J]. The Plant Journal，2007，49（05）：947-959.

[ 4 ] 肖景華，吳昌銀，張啟發(fā). 水稻功能基因組研究進(jìn)展與發(fā)展展

望[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2013，15（02）：1-7.

[ 5 ] Kikuchi S，Satoh K，Nagata T，et al. Col-

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28 000 cDNA clones from japonica rice[J].

Science，2003，301（5631）： 376-379.

（收稿日期：2018-07-17）