蔣謙才 譚宗健 廖浩斌 劉盼盼 孫紅梅 王瑞江 曹洪麟 黃向旭 賴思茹 梁丹 王崢峰

摘 要：土沉香（Aquilaria sinensis）是生產(chǎn)中藥沉香的重要樹種，現(xiàn)被列為國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物。該研究通過采集該地區(qū)83株土沉香樣品，利用限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測序（restriction siteassociated DNA sequencing，RADseq）方法獲得的18個(gè)微衛(wèi)星體作為分子標(biāo)記，計(jì)算了五桂山土沉香種群的整體觀測雜合度（observedheterozygosity）、期望雜合度（expectedheterozygosity）、種群整體近交系數(shù)及其個(gè)體間的親緣關(guān)系，并對種群可能經(jīng)歷的種群縮小或種群擴(kuò)張狀況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：與同屬其它物種以及同一生活史物種相比，五桂山地區(qū)土沉香遺傳多樣性略低（觀測雜合度和期望雜合度分別為0.523和0.522），但種群整體處于隨機(jī)交配狀態(tài)（近交系數(shù)為-0.002）。瓶頸效應(yīng)分析表明該種群沒有經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)，且81.810%的個(gè)體間無親緣關(guān)系，說明這一地區(qū)土沉香并非少數(shù)個(gè)體發(fā)育起來；種群擴(kuò)張分析表明其種群大小有增長情形。綜合這些結(jié)果可以看出，中山市五桂山土沉香種群整體遺傳健康狀況良好，較好地保存了該區(qū)域種質(zhì)資源遺傳多樣性，為今后的保護(hù)和合理開發(fā)提供了優(yōu)質(zhì)資源儲(chǔ)備。

關(guān)鍵詞：瓶頸效應(yīng)，親緣關(guān)系，微衛(wèi)星體，遺傳變異，種群擴(kuò)張

中圖分類號(hào)：Q319+.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：10003142（2018）06080408

Abstract：Aquilaria sinensis，famous of its fragrant wood，is listed as national Level Ⅱ protected wild plants. For sound conservation this precious population of A. sinensis in Wuguishan District of Zhongshan City，we conducted genetic diversity surveys on it. Because population history such as shrinking or expansion would definitely leave signatures in population genetic variations，based on the genetic diversity investigated in Wuguishan population of A. sinensis，we also made population history inferences for it. Among genetic diversity studies，microsatellite markers are the most suitable tools due to their high polymorphism. Therefore，using eighteen microsatellites obtained by restriction siteassociated DNA sequencing （RADseq），we examined the genetic diversities of 83 A. sinensis individuals collected from Wuguishan District，and estimated genetic diversity parameters by observedheterozygosity，expectedheterozygosity and inbreeding index. Because the genetic relationship between individuals could reflect whether Wuguishan population of A. sinensis was derived from a few ancestors，pairwise genetic relatedness was calculated and four types of relationship （parentoffspring，fullsiblings，halfsiblings and unrelated） between individuals were determined. The population history was inferred for population shrinking （bottleneck） or expansion. Overall，compared to the genetic variation of the species in the same genus and the species with similar life history traits，the genetic diversity in Wuguishan population was slightly low with the observedheterozygosity and expectedheterozygosity being 0.523 and 0.522，respectively. The value of -0.002 for inbreeding index，which was close to zero，indicated that the whole population was under random mating. Bottleneck analysis indicated bottleneck effects did not happened recently in Wuguishan population，which meant no population shrinking. Pairwise relationships between individuals confirmed this by showing most of individual pairs （>81.810%） were unrelated. Finally，we detected the evidence of population expansion on the basis of allele size distributions. Accordingly，these results indicated that Wuguishan population of A. sinensis is generally genetically healthy. Such information provides the reference for the conservation and the reasonable uses of A. sinensis in the future.

Key words：bottleneck effects，genetic relationship，microsatellites，genetic variation，population expansion

土沉香（Aquilaria sinensis）為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）多年生熱帶、亞熱帶常綠喬木，是中國特有物種。它為國產(chǎn)中藥沉香的正品來源，也是我國生產(chǎn)中藥沉香的唯一植物資源（賈文杰等，2010）。沉香不僅是我國傳統(tǒng)中藥材，更列為十大廣藥之一。但土沉香的結(jié)香是一個(gè)復(fù)雜的生物物理化學(xué)過程，其香氣至今無法人工合成。沉香被喻為植物中的鉆石，十分珍貴。野生土沉香主要分布于我國廣東、廣西、海南、云南等?。▍^(qū)），但在福建、臺(tái)灣、四川等省有栽培。由于人們?yōu)槟踩”├麨E采亂伐，土沉香遭到嚴(yán)重破壞，再加上其天然更新能力弱，導(dǎo)致土沉香野生資源日趨減少。目前，土沉香被列為國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物（《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》，1999），也被IUCN列為禁止貿(mào)易的種類。2016年廣東省頒布的《廣東省嶺南中藥材保護(hù)條例》把包括土沉香在內(nèi)的八種極具嶺南特色的中藥材作為首批地方特色資源進(jìn)行保護(hù)和開發(fā)，以實(shí)現(xiàn)規(guī)范利用沉香資源，促進(jìn)地區(qū)土沉香產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。沉香在我國具有悠久的歷史，其之譽(yù)源于隋唐，盛于宋代。而東莞地區(qū)是土沉香最主要種植地，品質(zhì)最優(yōu)。古時(shí)東莞為東莞縣，地域廣大，包括了現(xiàn)在的香港、深圳、寶安、中山及東莞市（梅全喜等，2007）。中山市原名香山縣，是東莞地區(qū)沉香中心和最主要產(chǎn)地（梅全喜等，2007，2011），即以“地宜香木”得名，是“中國沉香之鄉(xiāng)”，也是東莞地區(qū)沉香和“道地”性代表。雖然中山市土沉香也歷經(jīng)盜砍盜伐等破壞，但在其境內(nèi)五桂山及其周邊風(fēng)水林中還殘存一些較大土沉香植株，極具保護(hù)價(jià)值（梅全喜，2016）。五桂山是中山市的主要山脈，其中蘊(yùn)含豐富的物種資源，其中以土沉香最為著名。截止至今，當(dāng)其他地區(qū)的原始土沉香資源由于各類原因減少消失，五桂山還保留有眾多較原始土沉香，是這一區(qū)域土沉香資源寶庫，具有很重要的開發(fā)利用潛力。

遺傳多樣性是物種長期生存適應(yīng)的基礎(chǔ)（季維智和宿兵，1999；Shi，1993；Lankau & Strauss，2007；Kettenring et al，2014）。1980年的《世界自然資源保護(hù)大綱》和1992年《生物多樣性保護(hù)公約》中都把保護(hù)物種遺傳多樣性作為其中主要目標(biāo)。2014年我國又頒布了《加強(qiáng)生物遺傳資源管理國家工作方案（2014—2020年）》和《生物多樣性保護(hù)重大工程實(shí)施方案（2014—2020年）》。遺傳多樣性對于林業(yè)生產(chǎn)同樣具有非常重要的作用。2013年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織制定了《森林遺傳資源養(yǎng)護(hù)、可持續(xù)利用和開發(fā)全球行動(dòng)計(jì)劃》；2015年我國國家林業(yè)局《中國林業(yè)遺傳資源保護(hù)與可持續(xù)利用行動(dòng)計(jì)劃（2015—2025年）》把林業(yè)遺傳資源作為我國戰(zhàn)略資源，從調(diào)查、收集、保護(hù)、評價(jià)和利用等多個(gè)方面闡述了我國林業(yè)遺傳資源的至關(guān)重要性，表明當(dāng)前對我國林木遺傳多樣性的調(diào)查、保護(hù)和開發(fā)的迫切需求。因此開展中山市五桂山地區(qū)土沉香遺傳多樣性研究對于合理保護(hù)和開發(fā)這一珍貴的物種資源具有重要意義。針對此，利用微衛(wèi)星體分子標(biāo)記，我們開展如下兩方面的研究：（1）探討五桂山土沉香整體遺傳多樣性（大?。顩r。（2）考慮到歷史上對土沉香的破壞，利用遺傳多樣性數(shù)據(jù)，了解土沉香種群形成歷史狀況。包括五桂山土沉香種群是否經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)？個(gè)體間親緣關(guān)系如何？是否由較少殘留的個(gè)體發(fā)展起來的（導(dǎo)致個(gè)體間親緣關(guān)系很近）？種群形成過程是否有自然擴(kuò)張情形？即種群大小是否一直保持恒定，還是有明顯的擴(kuò)大。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)和樣品采集

研究地位于廣東省中山市五桂山生態(tài)保護(hù)區(qū)內(nèi)，五桂山生態(tài)保護(hù)區(qū)位于廣東省中南部，地處珠江出?？冢乩碜鴺?biāo)為113°20′—113°35′ E，22°16′—22°27′ N之間，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，光熱充足，雨量充沛，年均氣溫為22.0 ℃，極端最高氣溫36.7 ℃，極端最低氣溫-1.3 ℃，年均降水量為1 738 mm（蔣謙才等，2005）。研究區(qū)域內(nèi)土壤類型為赤紅壤，植被代表類型為熱帶季雨林型的常綠季雨林。五桂山主峰海拔531 m，是中山市最高峰；為中山市的“市肺”，總面積198.3 km2，是珠江口西岸唯一的大面積森林綠地（樊風(fēng)雷等，2013）。五桂山生態(tài)保護(hù)區(qū)內(nèi)動(dòng)植物資源豐富（蔣謙才等，2005，2006，2011；林俊新等，2006；黎清等，2011；張玉山等，2012），蘊(yùn)含多種珍稀瀕危植物，包括極具特色的土沉香。

在五桂山土沉香集中分布地區(qū)采集胸徑級大于5 cm的土沉香成熟個(gè)體，每株采集2～3片葉子，葉片采集后立刻放入裝有硅膠的密封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。本研究共采集到83株土沉香葉樣。

1.2 遺傳多樣性檢測

利用中國科學(xué)院華南植物園王崢峰所在實(shí)驗(yàn)室篩選到的18個(gè)微衛(wèi)星體對五桂山83株土沉香樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這18個(gè)微衛(wèi)星體采用限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測序（restriction siteassociated DNA sequencing，RADseq）方法獲得。具體步驟如下，首先利用中國科學(xué)院植物園采集的一個(gè)土沉香樣品，通過EcoR I內(nèi)切酶對它的總DNA進(jìn)行酶切。收集350～500 bp片段進(jìn)行建庫。再利用Illumina HiSeq 2500測序儀進(jìn)行雙端150 bp測序。對測序結(jié)果進(jìn)行過濾、拼接。對拼接后的序列參考王崢峰（2016）方法進(jìn)行微衛(wèi)星體序列的查找。對查找到的微衛(wèi)星體序列，我們隨機(jī)挑選其中100個(gè)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，多態(tài)性分析。最終確定18個(gè)有穩(wěn)定多態(tài)性的微衛(wèi)星體進(jìn)行土沉香遺傳多樣性研究。每個(gè)微衛(wèi)星體PCR擴(kuò)增均使用20 μL反應(yīng)體系，體系如下：2 μL 10× PCR 緩沖液，0.5 mmol·L1 dNTPs，正反引物各0.4 μmol·L1，約50 ng DNA模板，1 U Taq酶。PCR反應(yīng)程序如下：起始5 min 95 ℃變性，隨后35個(gè)循環(huán)進(jìn)行94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。每個(gè)微衛(wèi)星體均使用相同的退火溫度。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI 3730全自動(dòng)測序儀上用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行微衛(wèi)星體分型分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

土沉香遺傳多樣性分析：利用GenAlEx 6.501（Peakall & Smouse，2012）計(jì)算五桂山土沉香種群各位點(diǎn)等位基因數(shù)，各位點(diǎn)及其種群整體觀測雜合度（Observedheterozygosity）和期望雜合度（Expectedheterozygosity）；利用Genepop4.5.1軟件（Rousset，2008） 計(jì)算種群各位點(diǎn)及其種群整體近交系數(shù)f（Weir & Cockerham，1984），檢測其顯著性，并采用Bonferroni 糾正（Bonferroni correction）的方法進(jìn)行多重比較下的顯著性水平調(diào)整（Holm，1979）。f值反映種群是否處于哈迪—溫伯格平衡（HardyWeinberg Equilibrium），一種自由交配狀況。如果種群處于這一平衡，f值為0?？紤]到其中一個(gè)位點(diǎn)TCX22明顯偏離哈迪—溫伯格平衡（見結(jié)果與分析），在下面三個(gè)分析中，我們?nèi)コ薚CX22位點(diǎn)。

種群瓶頸效應(yīng)利用BOTTLENECK1.2.02（Piry et al，1999）進(jìn)行分析。在微衛(wèi)星突變模型選擇上，這里選擇兩相突變模型（Twophased model of mutation），用威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)（Wilcoxon SignedRanks Test）法進(jìn)行瓶頸效應(yīng)顯著度檢測。

個(gè)體間親緣關(guān)系利用MLrelate（Kalinowski et al，2006）軟件進(jìn)行分析。MLrelate軟件通過計(jì)算兩兩個(gè)體間的親緣系數(shù)，檢測個(gè)體之間如下親緣關(guān)系：親本—子代（PO，parentoffspring）關(guān)系，全同胞（FS，fullsiblings）關(guān)系，半同胞（HS，halfsiblings）關(guān)系和無關(guān)系（U，unrelated）四種類型。

種群擴(kuò)張采用kgtests軟件（Bilgin，2007）中的Ktest方法進(jìn)行分析。這一方法的原理是對于擴(kuò)張的種群，它的等位基因大小分布呈單峰性（Unimodal）；而對于種群大小恒定的種群，其等位基因大小分布呈多峰性（Multimodal）。Ktest中的k度量峰度（Kurtosis）狀態(tài)，中間值為0。位點(diǎn)k值小于0表示有種群擴(kuò)張的情形。如果所有檢測位點(diǎn)中k值小于0的位點(diǎn)比例顯著占優(yōu)，就表示種群有擴(kuò)張歷史。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

18個(gè)微衛(wèi)星體在五桂山土沉香種群中分別擴(kuò)增出2～13個(gè)等位基因，觀測雜合度在0.049～0.831之間，期望雜合度在0.094～0.800之間。近交系數(shù)檢測結(jié)果表明除了TCX22這個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪—溫伯格平衡，其余位點(diǎn)均處于哈迪—溫伯格平衡狀態(tài)（表1）。圖1為五桂山部分土沉香個(gè)體在TCX40位點(diǎn)的毛細(xì)管電泳結(jié)果。

種群水平的遺傳多樣性結(jié)果表明，五桂山土沉香觀測雜合度和期望雜合度分別是0.523和0.522，非常接近。近交系數(shù)也接近0，表明種群整體處于哈迪—溫伯格平衡。

2.2 瓶頸效應(yīng)分析

利用微衛(wèi)星體的兩相突變模型，瓶頸效應(yīng)分析中威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)結(jié)果是P=0.189，結(jié)果不顯著，表明五桂山土沉香沒有經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)。

2.3 個(gè)體間親緣關(guān)系分析

55個(gè)個(gè)體對表現(xiàn)為親本—子代關(guān)系，占全部個(gè)體對的1.616%（55/3 403），41個(gè)個(gè)體對表現(xiàn)為全同胞關(guān)系，占全部個(gè)體對的1.205%（41/3 403），523個(gè)個(gè)體對表現(xiàn)為半同胞關(guān)系，占全部個(gè)體對的15.369%（523/3 403）。其余2 784個(gè)個(gè)體對表現(xiàn)為沒有親緣關(guān)系，占81.810%。

2.4 種群擴(kuò)張分析

種群擴(kuò)張分析的ktest結(jié)果顯示，檢測的17個(gè)微衛(wèi)星體位點(diǎn)中，13個(gè)位點(diǎn)k值小于零（P=0.018），表明五桂山土沉香歷史上有種群擴(kuò)張情形。

3 討論與結(jié)論

利用ISSR（intersimple sequence repeat）和AFLP（amplified fragment length polymorphism）不同分子遺傳標(biāo)記，賈文杰等（2010）、楊春勇等（2013）和黃久香等（2014）都對土沉香遺傳多樣性開展過一些研究。結(jié)果表明土沉香物種水平上擁有較高的遺傳多樣性，但種群水平遺傳多樣性相對低些。由于ISSR和AFLP分子遺傳標(biāo)記為顯性遺傳標(biāo)記，無法區(qū)分雜合體，限制了其在物種交配系統(tǒng)、親本分析等領(lǐng)域的應(yīng)用。但由于其能揭示豐富的遺傳多樣性信息，因此ISSR和AFLP分子遺傳標(biāo)記還是有其優(yōu)越性。

本研究通過文獻(xiàn)查找，利用微衛(wèi)星體分子標(biāo)記，對土沉香同屬植物開展的研究只有馬來沉香（Aquilaria malaccensis）。而Singh et al（2015）的研究混合了三個(gè)種群觀測雜合度和期望雜合度結(jié)果，因此這兩個(gè)值的結(jié)果都較高于五桂山土沉香種群遺傳多樣性。但與Tnah et al（2012）對馬來沉香種群水平的遺傳多樣性結(jié)果相比，五桂山土沉香遺傳多樣性的兩個(gè)指標(biāo)略低。

本研究中，與同一生活史其它物種相比，五桂山土沉香種群遺傳多樣性兩個(gè)指標(biāo)（觀測雜合度和期望雜合度）都較低，其觀測雜合度和期望雜合度只高于種子重力傳播的物種。賈文杰等（2010）研究認(rèn)為，土沉香的種子兼具重力傳播和攝食傳播兩種方式。土沉香種子褐色，卵球形，長約1 cm，寬約5.5 mm。土沉香種子具有擬態(tài)性，種子附屬物可分泌化學(xué)信號(hào)誘導(dǎo)胡蜂取食，胡蜂取食時(shí)同時(shí)協(xié)助土沉香種子擴(kuò)散（胡超，2012；Chen et al，2016）。對同屬其它物種馬來沉香（A. malaccensis）種子擴(kuò)散研究表明，黃腰胡蜂（Vespa affinis）是其唯一種子傳播者，最長可以協(xié)助馬來沉香種子擴(kuò)散到500 m以外（Manohara，2013）?？紤]到土沉香種子的這種特性，其種子傳播方式應(yīng)該歸為攝食傳播。因此，在種子傳播方式上，土沉香遺傳多樣性應(yīng)該和種子攝食傳播物種相比。本研究中，種子攝食傳播物種的遺傳多樣性兩個(gè)指標(biāo)，觀測雜合度和期望雜合度，分別為0.72和0.73，高于五桂山土沉香種群這兩個(gè)遺傳多樣性指標(biāo)。綜上，我們可以看出，五桂山土沉香種群遺傳多樣性略低，但總體并沒有很大下降。同時(shí)，從近交系數(shù)f結(jié)果看，其值約為0，反映種群整體呈隨機(jī)交配狀況。

由于缺乏歷史資料，雖然現(xiàn)有五桂山土沉香種群散布在次生林中，并且有些個(gè)體胸徑級較大，如胸徑為33.9 cm，但其原始性尚無法判斷。雖然從現(xiàn)代規(guī)?；N植角度看，這些散生的土沉香個(gè)體不像是人為種植的，但考慮到中山市自唐宋以來是傳統(tǒng)的土沉香種植區(qū)，存在大規(guī)模的人工種植現(xiàn)象，因此五桂山現(xiàn)有的土沉香很有可能是當(dāng)年人工種植的土沉香種子擴(kuò)散后萌發(fā)而成。

人工栽培會(huì)導(dǎo)致栽培物種遺傳多樣性的明顯降低，這在很多栽培作物中有報(bào)道（Fineschi et al，2000；Lumaret et al，2004；Allan et al，2008；Li et al，2017；Sahu & Chattopadhyay，2017）。主要原因是人們在進(jìn)行人工栽培中會(huì)選擇某種優(yōu)良性狀的個(gè)體作為母系，然后后代均從這些少數(shù)母系繁育而來，從而導(dǎo)致栽培群體來源單一，遺傳多樣性降低。同時(shí)，從以往對土沉香不同種群遺傳分化的結(jié)果看，土沉香種群間存在較大的遺傳分化。如黃久香等（2014）對東莞及其鄰近地區(qū)的土沉香種群的遺傳分化研究結(jié)果為0.227；而賈文杰等（2010）對廣東、廣西、云南以及海南共8個(gè)種群的研究結(jié)果表明，土沉香種群間的遺傳分化達(dá)0.443。理論研究表明（Wright，1978），當(dāng)遺傳分化值為0～0.05之間，種群間遺傳分化程度低；當(dāng)遺傳分化值為0.05～0.15之間，種群間的遺傳分化程度中等；當(dāng)遺傳分化值為0.15～0.25之間，種群間的遺傳分化程度較大；當(dāng)遺傳分化值大于0.25時(shí)，種群間的遺傳分化程度很大。對比以往的結(jié)果，土沉香種群間有較大的遺傳分化，這導(dǎo)致種群間基因流不暢，降低種群內(nèi)遺傳多樣性。因此，理論上看，人工栽培和基因流不暢都會(huì)導(dǎo)致土沉香種群遺傳多樣性的降低。然而從我們的研究結(jié)果看，五桂山土沉香并沒有出現(xiàn)大的遺傳多樣性降低。其可能的原因是五桂山地區(qū)土沉香人工栽培種植面積較大，種源選擇較廣，使得五桂山土沉香種群形成沒有受到瓶頸效應(yīng)（個(gè)體數(shù)量限制）影響。個(gè)體間親緣關(guān)系遠(yuǎn)也證實(shí)了這點(diǎn)。雖然沒有很大的遺傳多樣性降低，但從上面的對比分析看，人工選擇栽培還是在一定程度上造成五桂山地區(qū)土沉香小部分遺傳多樣性丟失。近年來，有多人次對五桂山地區(qū)土沉香資源進(jìn)行過相關(guān)調(diào)查，估計(jì)其種群數(shù)量可達(dá)約4萬株（梅全喜，2016），表明這一地區(qū)現(xiàn)有土沉香種群生長狀況良好，符合我們對其種群擴(kuò)張的檢測結(jié)果。

綜上所述，從現(xiàn)有結(jié)果來看，五桂山土沉香種群遺傳多樣性稍低，種群整體健康，為該地區(qū)土沉香保護(hù)利用提供了遺傳多樣性保障。

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