張華玲 劉緒 楊春賢 黃元射 傅玉凡 張啟堂

摘 要：肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamic acid-4-hydroxylase， C4H，EC 1.14.13.11）是苯丙烷途徑中第二步反應(yīng)酶，同時也是花色素苷前體生物合成途徑中關(guān)鍵酶。該研究根據(jù)植物C4H的同源序列設(shè)計引物，通過RT-PCR結(jié)合RACE的方法，在紫色甘薯中獲得了與其相應(yīng)的C4H基因，命名為IbC4H（GenBank 登錄號GQ373157）。結(jié)果表明：（1）序列分析表明IbC4H長1 668 bp，編碼505個氨基酸，該氨基酸序列與其cDNA序列與IbC4H蛋白與馬鈴薯C4H蛋白序列最為接近，與蘋果、黑莓、大阿米芹、油菜一致性很高，均在70%以上。（2）二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明α-螺旋和無規(guī)則卷曲是IbC4H蛋白最大量的結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈則散布于整個蛋白中。（3）三維結(jié)構(gòu)建模預(yù)測，IbC4H蛋白具備細(xì)胞色素P450氧和鐵離子結(jié)合位點(diǎn)等典型的C4H結(jié)構(gòu)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步了解花色素苷生物合成途徑中的作用奠定了基礎(chǔ)，也為花青素生物合成分子機(jī)理和代謝調(diào)控提供了靶位點(diǎn)和理論參考。

關(guān)鍵詞：甘薯， 肉桂酸-4-羥化酶， 基因克隆， 序列分析

中圖分類號：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）04-0501-08

Abstract：（Cinnamic acid-4-hydroxylase ， C4H，EC 1.14.13.11） is the second key enzyme involved in the biosynthetic pathway of phenylpropanoid and precursors of anthocyanin biosynthesis. Based on cDNA sequence conserved domain of C4H，a pair of primers were designed and used to amplify a fragment of IbC4H gene （GenBank accession：GQ373157） by RT-PCR from sweet potato using RT-PCR and RACE technique. A 1 668 bp full-length cDNA sequence was obtained. Analysis of C4H cDNA indicated that it encoded a peptide containing 505 amino acids and the sequence comparison with the C4H gene of potatoes， apples， blackberries， ammi majus and rapes showed that identity was all above 70%. The predicted secondary structure demonstrated that alpha helix and random coil were the most important structural conformation. However， extended chain distributed in the whole protein. The predicted tertiary structure demonstrated that IbC4H had binding sites of cytochrome P450 with oxygen and iron. The study will be helpful to understand more about the roles involved in anthocyanin biosynthesis at the molecular level and provides a candidate genes for metabolic engineering of anthocyanin biosynthesis pathway in purple-fleshed sweetpotato.

Key words：sweet potato， cinnamic acid-4-hydroxylase， gene cloning， sequence analysis

甘薯，學(xué)名（Ipomoea batatas），是旋花科（Convolvulaceae）甘薯屬（Ipomoea）中的一個栽培種，具有蔓生習(xí)性的一年生（溫帶）或多年生（熱帶）草本、雙子葉植物（Woolfe， 2008）。甘薯薯肉色澤鮮艷，種類繁多，其中一類為紫色甘薯，富含花色素苷?；ㄉ剀绽砘再|(zhì)穩(wěn)定，具有抗氧化活性、預(yù)防腫瘤和癌癥等多種生理功能，在食品著色、醫(yī)藥保健、化妝品方面有著較大的應(yīng)用潛力（肖素榮和李京東，2009）。

肉桂酸-4-羥化酶（C4H，EC1.14.13.111）是苯丙烷途徑的第2個關(guān)鍵酶，同時也是花色素苷前體生物合成途徑中的關(guān)鍵酶（陳鴻翰等，2013）。C4H催化反式肉桂酸的反應(yīng)形成4-N基肉桂酸，也是第一個氧化反應(yīng)。肉桂酸-4-羥化酶在細(xì)胞中含量的多少，直接影響多條代謝支路。苯丙烷途徑的核心關(guān)鍵酶形成一個復(fù)合物，而C4H在苯丙烷途徑（位于胞質(zhì)中）與電子傳遞反應(yīng)（位于膜上）之間起到重要作用（陳安和，2006）。C4H的克隆及代謝研究在白木香（梁良等，2014）、青稞（羅小嬌等，2014）、油菜（陳安和，2006）、煙草（Annette et al， 2007）、馬鈴薯（Boddu et al， 2004）、苦蕎（陳鴻翰等，2013）和菘藍(lán)（胡永勝等，2015）等物種已有報道，但未見甘薯中克隆。為了進(jìn)一步揭示花色素苷合成的分子機(jī)制，豐富花色素苷生物合成途徑中的相關(guān)酶體系基因，本研究以紫色甘薯為材料，采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆甘薯C4H基因，命名為IbC4H（GenBank登錄號：GQ373157），并進(jìn)行生物信息分析，旨在為構(gòu)建植物表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備，從而為利用分子育種方法提高花色素苷的含量提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 材料

該實(shí)驗(yàn)材料由西南大學(xué)甘薯工程研究中心提供，富含花色素的紫色甘薯新品種‘渝紫263（張啟堂等，2004）。選取幼嫩部分葉片，經(jīng)液氮速凍處理后保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 甘薯中C4H的獲得

‘渝紫263的RNA根據(jù)RNA提取試劑盒（北京天根）上的說明書進(jìn)行提取，按照RNA PCR （AMV） Ver. 3.0 （TaKaRa 公司）的使用說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA鏈，-20 ℃保存。NCBI在線查找馬鈴薯、擬南芥、藿香、茶樹、燕麥、喜樹、蕓香等植物的C4H全長cDNA的編碼區(qū)序列（coding sequence，CDS），利用Vector NTI Suite 8.0對C4H核苷酸序列進(jìn)行多重比對，選取其合適的保守位點(diǎn)進(jìn)行核心引物設(shè)計，進(jìn)而設(shè)計3′端、5′端及全長的引物。由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成引物，引物序列如表1所示。引物設(shè)計方法以及序列的擴(kuò)增方法及擴(kuò)增條件參照苦蕎黃烷酮3-羥化酶基因F3H的克隆及序列分析文章（張華玲等，2010）進(jìn)行， PCR檢測后由Invitrogen公司測序。

以‘渝紫263葉片的cDNA為模板，以C4H-f、C4H-r核心引物進(jìn)行PCR核心片段的擴(kuò)增。C4H核心片段擴(kuò)增條件作出修改，預(yù)變性時間為5 min，退火溫度設(shè)為50～60 ℃，54.5 ℃退火45 s，30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物回收純化，克隆至載體中，制作大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入，鑒定菌落并測序。接著進(jìn)行3′和5′ RACE擴(kuò)增， 3′ RACE的二次擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)改為30個循環(huán)；5′ RACE 條件做一定修改，退火階段72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)； 最后72 ℃延伸10 min進(jìn)行5′RACE的二次擴(kuò)增。最后以全長引物C4H-fl-f、C4H-fl-r為引物，cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，94 ℃預(yù)變性10 min； 94 ℃變性 45 s，64.5 ℃退火 45 s，72 ℃延伸10 min，34個循環(huán)擴(kuò)增全長序列。

1.3 生物信息學(xué)分析

EditSeq軟件序列分析與拼接后，將甘薯C4H的核苷酸序列和氨基酸序列在NCBI中BLAST比對，接著利用Vector NTI 8.0軟件進(jìn)行甘薯C4H及其他植物C4H的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，分析相似性。從GenBank中查找得到10個植物物種的C4H蛋白氨基酸序列，根據(jù)Neighber-joining方法（MEGA7）將IbC4H與它們構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap檢驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為1 000次，從而分析得到不同物種中的C4H基因之間的分子進(jìn)化關(guān)（Kumar et al，2001）。ProtScale進(jìn)行甘薯C4H基因編碼蛋白的氨基酸序列疏水性預(yù)測，在GOR和Target P上進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位分析，IbC4H結(jié)構(gòu)的三維建模利用SWISSMODEL在線程序進(jìn)行，利用ViewerLite 4.2 軟件進(jìn)行編輯，得到甘薯C4H三級結(jié)構(gòu)模型。

甘薯C4H生物信息學(xué)分析參照張華玲等（2010）的苦蕎黃烷酮3-羥化酶基因F3H的克隆及序列分析方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯C4H的編碼序列的獲得及生物信息學(xué)分析

以紫薯葉片反轉(zhuǎn)得到cDNA，采用簡并引物對其擴(kuò)增獲得長為524 bp的甘薯C4H基因核心片段，并通過NCBI進(jìn)行BLAST比對，比對結(jié)果顯示該序列與來源于馬鈴薯（EU391448）等的cDNA序列同源性高達(dá)80%，表明已成功擴(kuò)增IbC4H核心片段。根據(jù)IbC4H核心片段序列信息，設(shè)計5′RACE引物和3′RACE分別擴(kuò)增得到534 bp左右的5′端和743 bp左右的3′端，用Edit Seq軟件進(jìn)行序列分析，將核心片段、3′端和5′端拼接獲得全長1 668 bp，包括65 bp 5′端UTR、1 518 bp編碼區(qū)、85 bp的3′端UTR和14 bp的polyA尾巴（圖1）。根據(jù)該序列設(shè)計引物，擴(kuò)增cDNA全長序列并進(jìn)行BLAST比對。比對結(jié)果顯示與藿香（Agastache rugosa，GenBank AY616436.1）和爬山虎（Parthenocissus henryana， DQ211885.1）相似性均為81%；與火炬松（Pinus taeda，AY764841.1）相似性為80%；與銀合歡（Leucaena leucocephala，GU183363.1）和黑莓（Rubus occidentalis）為79%；與插田泡（R. coreanus，GenBank EU123533.1）和蘋果梨（Malus × domestica，GenBank DQ075002.1）為78%；長春花 （Catharanthus roseus GenBank Z32563.1）77%；與油菜（Brassica napus，GenBank DQ485129.1），蕪菁（B. rapa ，GenBank AB300317.1），大阿米芹（Ammi majus，GenBank AY219918.1）和香芹（Petroselinum crispum，GenBank L38898.1）均為76%。

利用DNAman軟件進(jìn)行分析，從圖2可以看出，IbC4H的cDNA序列含有66～1 583 bp的開放閱讀框以及85 bp的3′非編碼區(qū)和65 bp的5′非編碼區(qū)。IbC4H終止密碼子為TAA，共編碼505個氨基酸，符合有效翻譯的基因全長cDNA特征。

IbC4H氨基酸序列提交http：//www.expasy.org預(yù)測，分子量58.16 kD，等電點(diǎn)為9.23，其中95個極性氨基酸和190個疏水性氨基酸殘基。疏水性蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測在細(xì)胞質(zhì)。

2.2 不同植物的C4H氨基酸序列多重比對

利用Vector NTI 8.0軟件對甘薯和其他植物的C4H氨基酸序列進(jìn)行多重比對，并分析它們的相似性（圖3）。由圖3可知，IbC4H與馬鈴薯C4H序列相似性最高，與蘋果、黑莓較為接近，而與大阿米芹、油菜差異稍微大些，但是一致性仍很高，均在70%以上，可見C4H編碼區(qū)高度保守，從而進(jìn)一步證明所克隆出的基因確實(shí)是甘薯C4H基因。分析由于這些植物生長過程需積累大量黃酮類化合物，而C4H是催化類黃酮前體肉桂酸合成的重要酶，推測其基因必須保持足夠的遺傳穩(wěn)定性和演化趨向性。

2.3 C4H分子系統(tǒng)發(fā)生樹分析

將IbC4H與從GenBank中得到了黑莓（Rubus occidentalis，GenBank FJ554629.1）、插田泡（R. coreanus，GenBank EU123533.1）、蘋果梨（Malus × domestica，GenBank DQ075002.1）、長春花 （Catharanthus roseus， GenBank Z32563.1）、甘薯（Ipomoea batatas， GenBankGQ373157.1）、馬鈴薯（Solannum tuberosum，GenBank：DQ341174.1）、大阿米芹（Ammi majus， GenBank AY219918.1）、香芹（Petroselinum crispum， GenBank L38898.1）、油菜（Brassica napus， GenBank DQ485129.1）和蕪菁（B. rapa， GenBank AB300317.1） 10個植物物種的C4H蛋白序列，用Neighber-joining方法（MEGA7）構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，用以分析不同物種中的C4H基因之間的進(jìn)化關(guān)系（圖4），Bootstrap檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為1 000次。結(jié)果顯示IbC4H與茄科馬鈴薯C4H蛋白相似性最高，進(jìn)化樹上遺傳距離也最為接近，聚為一類。樹莓、插田泡、蘋果同為薔薇科植物，所以聚為一大類，并且這類植物和長春花有相同的特點(diǎn)，即色澤鮮艷，富含花青素。IbC4H位于花色素途徑的上游，除了與合成黃酮類化合物進(jìn)而合成花青素有關(guān)，還與合成木質(zhì)素緊密相關(guān)，而木質(zhì)素中一個重要的成分就是纖維素。因此，和富含纖維素的芹菜、芫荽，還有油菜、蕪菁也有一定關(guān)聯(lián)。其中芹菜、芫荽同為聚傘房花科，聚為一類；而油菜、蕪菁同為十字花科，聚為一類。在進(jìn)化樹上不僅與所屬科屬類別親緣關(guān)系相近，也和BLAST和多重比對結(jié)果相符。

2.4 IbC4H的蛋白結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)IbC4H的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，在IbC4H多肽鏈中含有44.55%的α-螺旋， 13.47%的延伸鏈，和41.98%的無規(guī)則卷曲?？v觀蛋白的整體結(jié)構(gòu)，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是IbC4H蛋白最大量的結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈則散布于整個蛋白中（圖5）。用TMHMM Server對甘薯基因C4H功能結(jié)構(gòu)域分析，甘薯C4H肽鏈在細(xì)胞膜外，IbC4H不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。用ProtScale進(jìn)行甘薯C4H基因編碼蛋白的氨基酸序列預(yù)測，整條多肽鏈表現(xiàn)為輸水性，在N端和近C端有較為明顯的輸水區(qū)域。在PROSITE中分別預(yù)測，IbC4H含有細(xì)胞色素P450血紅素半胱氨酸鐵元素結(jié)合位點(diǎn)（440～449位氨基酸殘基）、N-糖基化位點(diǎn)（57～60位、272～275位氨基酸殘基）、依賴于CAMP-CGMP蛋白激酶磷酸結(jié)合位點(diǎn)（262～265位氨基酸殘基）。此外，還含有蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、N-豆蔻?；稽c(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)。三維結(jié)構(gòu)建模預(yù)測， 丙氨酸306位殘基所在側(cè)鏈，苯丙氨酸119位殘基及絲氨酸120殘基，天冬氨酸294位殘基，蘇氨酸310位殘基，苯丙氨酸203位殘基共同形成一個穴狀的結(jié)構(gòu)，其中蘇氨酸和天冬氨酸參與水分子的氫鍵的連接，增加結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。絲氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸是酶的結(jié)合位點(diǎn)，該催化中心含有水分子、氧及鐵元素結(jié)合位點(diǎn)，和其它關(guān)于人類細(xì)胞色素P450氧化及相關(guān)結(jié)構(gòu)模型研究結(jié)果相一致（Wilmouth et al，2002； Stefaan et al，2007； Linda et al，1986）。

3 討論

花色素苷合成要經(jīng)由苯基丙酸路徑和類黃酮生合成途徑生成，除合成木質(zhì)素、類黃酮物質(zhì)，還合成香豆素、綠原酸等物質(zhì)，作為植物的信號分子或拮抗物質(zhì)。肉桂酸-4-羥化酶催化反式肉桂酸的反應(yīng)形成4-N基肉桂酸，是苯丙烷途徑的第2個關(guān)鍵酶，屬于細(xì)胞色素單加氧酶超家族。苯丙烷途徑的核心關(guān)鍵酶形成一個復(fù)合物，C4H在苯丙烷途徑（位于胞質(zhì)中）與電子傳遞反應(yīng)（位于膜上）之間起著重要作用（梁良等，2014；陳安和，2006）。Blount et al（2000）的研究表明，轉(zhuǎn)基因煙草中肉桂酸-4-羥化酶酶過量表達(dá)將導(dǎo)致綠原酸的含量的增加。目前已對擬南芥、水稻、油菜、青稞、大豆等多種植物C4H基因進(jìn)行了分離和克隆，（Annette et al， 2007； Boddu et al， 2004；羅小嬌等，2014； 王安娜等，2010）。譚國飛等（2014）通過定量、半定量PCR，檢測C4H基因在不同組織中的表達(dá)，如鴨兒芹中基因與溫度的響應(yīng)表達(dá)，為其生長環(huán)境的分析提供了重要依據(jù)；利用實(shí)時熒光定量PCR 分析青稞C4H在胚乳發(fā)育不同組織的表達(dá)情況，對品種改良等有重要意義（羅小嬌等，2014）。本研究成功克隆了紫色甘薯C4H基因，同時進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為利用植物次生代謝途徑中關(guān)鍵酶的“基因修飾”技術(shù)， 調(diào)節(jié)甘薯C4H的活性來增加色素的含量及黃酮類含量奠定了基礎(chǔ)，目前，在甘薯中C4H的表達(dá)水平與黃酮和紫色色素積累量的關(guān)系有待進(jìn)一步研究分析，后期還將研究紫薯花色素苷合成途徑中其他關(guān)鍵基因，分析其表達(dá)與花色素苷總量的關(guān)系，探究黃酮類化合物生物合成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而對天然色素新品種的研發(fā)提供重要依據(jù)。

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