吳磊 居文政 戴國梁 陸超

摘 要 目的：建立大鼠血漿中大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮含量的測定方法，并研究大鼠體內(nèi)芪雪浸膏劑的藥動學(xué)。方法：采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）法。色譜柱為Thermo C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為20 ?L，定量離子為大黃素質(zhì)荷比（m/z）269.7→226.1，大黃酸m/z 283.7→239.9，毛蕊異黃酮m/z 283.5→268.5，地西泮（內(nèi)標(biāo)物）m/z 285.0→154.1。6只大鼠灌胃芪雪浸膏劑8.91 g/kg（按臨床用量換算而得）后0.08、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12 h眼眶取血測定血藥濃度。采用DAS 1.0藥動學(xué)軟件計算各藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果：大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.988～198.8 ng/mL（r=0.998 8）、2～200 ng/mL（r=0.998 8）、2.092～209.2 ng/mL（r=0.998 5），精密度、準(zhǔn)確度試驗的RSD均小于7.78%（n=5），基質(zhì)效應(yīng)分別為92.13%～102.23%、90.15%～93.67%、90.33%～104.63%（n=5），穩(wěn)定性試驗的RSD均小于6.54%（n=3）；3種成分在大鼠體內(nèi)的t1/2分別為（1.95±0.53）、（3.55±1.25）、（4.21±1.14） h，AUC0-12 h分別為（192.67±40.58）、（93.67±20.26）、（608.41±108.36） ?g·h/L，cmax分別為（89.56±12.87）、（31.84±10.58）、（300.56±50.57） ?g/L，tmax分別為（0.50±0.00）、（0.75±0.23）、（1.00±0.00） h，CL分別為（5.45±1.12）、（2.09±0.47）、（10.01±1.25） L/（h·kg）（n=6）。結(jié)論：建立的方法靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮在大鼠體內(nèi)的消除過程為一級消除，且符合二室開放模型。

關(guān)鍵詞 芪雪浸膏劑；大黃素；大黃酸；毛蕊異黃酮；藥動學(xué)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；大鼠

中圖分類號 R285.5 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）21-2935-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.13

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of emodin， rhein and calycosin in rat plasma， and to study pharmacokinetics of Qixue extract in rats. METHODS： LC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on Thermo C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid solution （gradient elution）， and flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 20 ?L. The quantitative ions were emodin m/z 269.7→226.1， rhein m/z 283.7→239.9， calycosin m/z 283.5→268.5 and diazepam m/z 285.0→154.1. The blood concentration of samples from orbital cavity of 6 rats were determined 0.08， 0.17， 0.25， 0.5， 0.75， 1， 2， 4， 6， 8， 12 h after intragastric administration of Qixue extract 8.91 g/kg （by clinical dosage）. DAS 1.0 pharmacokinetic software was employed to calculate pharmacokinetic parameters. RESULTS： The linear ranges of emodin， rhein and calycosin were 1.988-198.8 ng/mL （r=0.998 8）， 2-200 ng/mL （r=0.998 8） and 2.092-209.2 ng/mL（r=0.998 5）， respectively. RSDs of precision and accuracy tests were all less than 7.78% （n=5）. The recoveries were 92.13%-102.23%， 90.15%-93.67% and 90.33%-104.63% （n=5）， respectively. RSDs of stability tests were all less than 6.54% （n=3）. The pharmacokinetic parameters of emodin， rhein and calycosin were as follows as t1/2 were （1.95±0.53）， （3.55±1.25）， （4.21±1.14） h； AUC0-12 h were （192.67±40.58）， （93.67±20.26）， （608.41±108.36） ?g·h/L； cmax were （89.56±12.87）， （31.84±10.58）， （300.56±50.57） ?g/L； tmax were （0.50±0.00），（0.75±0.23），（1.00±0.00） h； CL were （5.45±1.12）， （2.09±0.47）， （10.01±1.25） L/（h·kg） （n=6）， respectively. CONCLUSIONS： Established method is highly sensitive， accurate and reliable. The elimination process of emodin， rhein and calycosin are first-order elimination， which is in line with two-compartment model.

KEYWORDS Qixue extract； Emodin； Rhein； Calycosin； Pharmacokinetics； LC-MS/MS； Rats

芪雪浸膏劑由黃芪、六月雪、當(dāng)歸、虎杖、土茯苓、懷牛膝等共11味飲片組成，為江蘇省中醫(yī)院孫偉教授首創(chuàng)“益腎清利活血方”（后規(guī)范命名為“芪雪浸膏劑”），用以治療慢性腎臟病，具有清熱活血、清利除濕、祛風(fēng)通絡(luò)、益腎清利、和絡(luò)泄?jié)岬墓π?；對代償期與失代償期的慢性腎功能衰竭患者具有穩(wěn)定其腎功能的作用；對腎功能衰竭期及尿毒癥晚期的患者可延緩其腎功能進行性惡化的速度[1]。相關(guān)研究表明，該方可顯著地降低蛋白尿[2]，延緩慢性腎功能衰竭的進展[3]，長期堅持治療可明顯改善患者的生活質(zhì)量[4]。目前針對該方的研究多集中在臨床應(yīng)用方面[5-7]，未見藥動學(xué)特性方面的相關(guān)報道。在前期研究中，筆者考察了芪雪浸膏劑中大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮、大黃素甲醚、金絲桃苷、黃芪甲苷等共9種成分的含量測定方法，但在進行體內(nèi)預(yù)實驗的時候發(fā)現(xiàn)，僅大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮這3種成分在大鼠血漿的含量較高。因此，本文建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）方法，考察了芪雪浸膏劑中大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮在大鼠體內(nèi)的血藥濃度和藥動學(xué)參數(shù)，為芪雪方浸膏劑的臨床應(yīng)用提供實驗支持。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Fisher TSQ質(zhì)譜儀，包括電噴霧離子源、Xcalibar 1.4工作站（美國Thermo公司）；DionexU超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Dionexu公司）；BP-211D電子分析天平（德國Sartorius公司）；AR 2140萬分之一天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；VORTEX多功能渦旋混合器（美國Scientific公司）；5430R冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪（批號：15020201）、六月雪（批號：15070602）、當(dāng)歸（批號：14120301）、虎杖（批號：15050701）、土茯苓（批號：15062704）、懷牛膝（批號：15022801）均購自江蘇省醫(yī)藥有限公司；大黃素對照品（批號：140410，純度：>98%）、大黃酸對照品（批號：140919，純度：>98%）、毛蕊異黃酮對照品（批號：140928，純度：>98%）均購自南京寧岐醫(yī)藥科技有限公司；地西泮（內(nèi)標(biāo)物，中國食品藥品檢定研究院，批號：171225-200903，純度：≥99%）；乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水。

1.3 動物

SD大鼠，SPF級，♂，6只，體質(zhì)量240～260 g，由南通大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK-（蘇）2014-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Thermo C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）梯度洗脫（0～1 min，25%A；1～5.5 min，25%→90%A；5.5～9 min，90%A；9～9.5 min，90%→25%A；9.5～13 min，25%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 ?L。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧（ESI）；檢測模式：正負(fù)離子切換模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；噴霧電壓：（+）4 000/（-）3 000 V；離子源溫度：200 ℃；毛細(xì)管溫度：270 ℃；鞘氣（N2）壓力：20 Arb；輔助氣（N2）壓力：5 Arb。定量離子為大黃素質(zhì)荷比（m/z）269.7→226.1，大黃酸m/z 283.7→239.9，毛蕊異黃酮m/z 283.5→268.5，地西泮m/z 285.0→154.1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 取大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮對照品適量，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0.994、56.8、1.046 mg/mL的單一對照品貯備液。取上述3種單一對照品貯備液適量，加甲醇配制成每1 mL含大黃素19.88 μg、大黃酸20 μg、毛蕊異黃酮20.92 μg的混合對照品溶液。以上溶液均保存于4 ℃冰箱。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 取地西泮對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成502.5 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃保存，備用。

2.2.3 芪雪浸膏劑的制備 取黃芪、當(dāng)歸、六月雪、虎杖、土茯苓、懷牛膝等11味飲片適量，加入10倍量水，加熱回流提取2次，每次40 min，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至稠膏狀，干燥，粉碎，過4號篩，即得浸膏粉末（每1 g原藥材相當(dāng)于0.6 g浸膏粉末，分別含大黃素31.17 μg、大黃酸23.16 μg、毛蕊異黃酮15.58 μg）。

2.3 血漿樣品處理

取血漿樣品100 ?L，加入甲醇400 ?L，渦旋振蕩5 min，離心（30 130×g，下同）5 min，取上清液于40 ℃真空揮干，再加入150 ?L甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩5 min，離心5 min，取上清液20 ?L，進樣測定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取空白血漿（不加內(nèi)標(biāo)）、單一對照品溶液（加10 ?L內(nèi)標(biāo)）、灌胃給藥2 h后大鼠血漿（加10 ?L內(nèi)標(biāo)），按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮和地西泮互不干擾，峰形良好，且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)也不干擾其測定，基線平穩(wěn)。樣品總離子圖見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系與定量下限 取空白血漿100 ?L，分別加入大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮混合對照品溶液各10 ?L，配制成大黃素血漿質(zhì)量濃度為1.988、4.97、9.94、19.88、49.7、99.4、198.8 ng/mL，大黃酸血漿質(zhì)量濃度為2、5、10、20、50、100、200 ng/mL，毛蕊異黃酮血漿質(zhì)量濃度分別為2.092、5.23、10.46、20.92、52.3、104.6、209.2 ng/mL的模擬血漿樣品。按“2.3”項下方法處理后，取20 ?L按“2.1”項下條件進樣測定。以各成分峰面積（y）對血漿質(zhì)量濃度（x）進行線性回歸，得大黃素回歸方程為y=0.000 9x+0.003 3（r=0.998 8），線性范圍為1.988～198.8 ng/mL，定量下限為1.988 ng/mL；大黃酸回歸方程為y=0.000 7x+0.002 6（r=0.998 8），線性范圍為2～200 ng/mL，定量下限為2 ng/mL；毛蕊異黃酮回歸方程為y=0.001 8x-0.001 7（r=0.998 5），線性范圍為2.092～209.2 ng/mL，定量下限為 2.092 ng/mL。

2.4.3 精密度 取空白血漿100 ?L，按“2.4.2”項下方法制備低、中、高3個質(zhì)量濃度（大黃素：1.988、19.88、198.8 ng/mL；大黃酸：2、20、200 ng/mL；毛蕊異黃酮：2.092、20.92、209.2 ng/mL）的血漿質(zhì)控（QC）樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣測定，記錄色譜圖。每個質(zhì)量濃度同日內(nèi)連續(xù)測定5次，考察日內(nèi)精密度；另每天測定1次，連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。結(jié)果，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮日內(nèi)RSD分別為≤5.66%、≤4.71%、≤6.14%（n=5）；日間RSD分別為≤5.34%、≤5.07%、≤7.78%（n=3）。

2.4.4 準(zhǔn)確度 取空白血漿100 ?L，按“2.4.3”項下方法制備低、中、高不同質(zhì)量濃度的QC樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項條件進樣測定，記錄色譜圖。以大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮峰面積計算的相應(yīng)質(zhì)量濃度與真實質(zhì)量濃度的比值計算回收率。結(jié)果，大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮低、中、高3個質(zhì)量濃度樣品的回收率分別為大黃素78.50%、84.67%、89.33%，大黃酸81.43%、87.45%、94.82%，毛蕊異黃酮82.51%、83.05%、94.33%，RSD分別為4.22%～5.20%、2.78%～3.97%、2.17%～4.38%（n=5）。

2.4.5 基質(zhì)效應(yīng) 取離心管數(shù)只，分別精密加入10 ?L低、中、高3個質(zhì)量濃度（大黃素質(zhì)量濃度為1.98、19.88、198.8 ng/mL，大黃酸質(zhì)量濃度為2、20、200 ng/mL，毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度為2.092、20.92、209.2 ng/mL）混合對照品溶液，再加入10 ?L內(nèi)標(biāo)及80 ?L水，渦旋30 s，離心5 min，按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積A。另按“2.3”項下方法制備空白血漿數(shù)管，揮干后同上操作，記錄峰面積B?；|(zhì)效應(yīng)公式為B/A×100%。結(jié)果，大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮血漿樣品低、中、高3個質(zhì)量濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為大黃素95.26%、92.13%、102.23%，大黃酸93.67%、92.97%、90.15%，毛蕊異黃酮96.80%、90.33%、104.63%（n=5）。

2.4.6 樣品穩(wěn)定性考察 取空白血漿100 ?L，按“2.4.3”項下方法制備低、中、高3個不同質(zhì)量濃度的QC樣品，按“2.3”項下方法處理后，分別在室溫（約25 ℃）下放置12 h、-20 ℃反復(fù)凍融3次、-80 ℃凍存10 d后進行穩(wěn)定性考察，每個質(zhì)量濃度平行測定3份。結(jié)果，經(jīng)處理后的QC樣品室溫放置12 h后，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮的峰面積的RSD均<6.49%（n=3），經(jīng)過-20 ℃反復(fù)凍融3次后峰面積的RSD均<6.54%（n=3），經(jīng)過-80 ℃凍存10 d后峰面積的RSD均<6.11%（n=3）。

2.5 藥動學(xué)實驗

取SD大鼠6只，給藥前12 h禁食不禁水，分別灌胃給予芪雪浸膏劑8.91 g/kg（按臨床用量換算而得），大鼠分別于給藥前及給藥后0.08、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12 h眼眶取血約0.3 mL，置于肝素化試管中，離心10 min，取上層血漿。按照“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣測定。利用回歸方程計算各峰面積對應(yīng)的血藥濃度，應(yīng)用DAS 1.0分析得出主要藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮在大鼠體內(nèi)的消除過程均屬一級消除，符合二室開放模型。單劑量灌胃芪雪浸膏劑后大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮的藥-時曲線見圖2，主要藥動學(xué)參數(shù)見表1。

3 討論

芪雪浸膏劑是根據(jù)我院孫偉教授首創(chuàng)的“益腎清利活血方”制備而成，經(jīng)腎內(nèi)科50多年的臨床經(jīng)驗積累、提煉，長期應(yīng)用于臨床，其相關(guān)的藥理作用報道較多[8-9]，但是方中潛在活性成分包括大黃素甲醚、大黃素、毛蕊異黃酮、大黃酸、槲皮素、楊梅素、虎杖苷、金絲桃苷、黃芪甲苷等在人體內(nèi)的藥動學(xué)特征尚不清楚[10-12]。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，筆者選擇大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮對芪雪浸膏劑在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征進行了初步考察。試驗前考察了血漿樣品中待測成分的提取方法，比較了甲醇沉淀法、乙腈沉淀法、乙酸乙酯萃取法、正丁醇萃取法對回收率的影響[10，13]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇沉淀法回收率高，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，樣品峰形較好，故選擇甲醇沉淀法作為血漿前處理的方法。本試驗選擇地西泮作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)[14]，其與待測物質(zhì)大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮保留時間適宜，峰形良好，無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。試驗建立了大鼠血漿中上述成分同步定量的LC-MS/MS法，結(jié)果表明，所建立的方法迅速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可以滿足生物樣本中的定量要求。

藥動學(xué)研究結(jié)果表明，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮均可被快速吸收入血，大鼠灌胃芪雪浸膏劑后5 min即可被檢測到，大黃素達峰時間在0.5 h左右，大黃酸達峰時間在0.75 h左右，毛蕊異黃酮達峰時間在1 h左右。灌胃8 h后大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮均表現(xiàn)為血藥濃度迅速降低，僅有少量被檢測到。總體而言，相比于毛蕊異黃酮，大黃素和大黃酸在大鼠血漿中的含量較少、持續(xù)時間較短。

本研究建立了LC-MS/MS法測定芪雪浸膏劑中大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮的含量，并對3種主要成分在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)進行了考察，可為后續(xù)深入的體內(nèi)藥動學(xué)研究提供參考。

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（收稿日期：2018-07-06 修回日期：2018-08-18）

（編輯：唐曉蓮）