堿性蛋白酶提取湘蓮蛋白質(zhì)的工藝優(yōu)化

江玉琴　柯偉倩　鄧放明

[摘要]湘蓮自古以來被作為一種營養(yǎng)保健食品，為高蛋白、低脂肪類食物，其蛋白質(zhì)含量達約17%。為了更好地開發(fā)利用湘蓮蛋白質(zhì)，通過測定蛋白提取率，考察堿性蛋白酶用量、提取溫度、提取時間以及液料比等要素對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響，并優(yōu)化確定其最佳提取方法，即在液料比為20：1的條件下，加入1.8%的堿性蛋白酶，在50℃下提取2h，湘蓮蛋白質(zhì)的提取率可達92.61%，為工業(yè)生產(chǎn)中湘蓮蛋白質(zhì)的提取提供了技術(shù)支撐。

[關(guān)鍵詞]湘蓮；蛋白質(zhì)；堿性蛋白酶；提取率

中圖分類號：Q814.1 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180227

蓮是起源較早的被子植物之一，在經(jīng)典植物學(xué)分類中蓮屬被置于毛莨目睡蓮科，世界上現(xiàn)存蓮屬有中國蓮和美洲黃蓮兩類。據(jù)現(xiàn)代研究分析，蓮子不僅富含糖類化合物和蛋白質(zhì)，還含有豐富的鈣、鎂、磷，以及鐵、鋅、錳、銅等多種人體必需微量元素和VB、VC等人體必需的維生素，具有一定食療功效。

湘蓮起源于中國單瓣古蓮的原始栽培種，與福建建蓮、廣昌白蓮、武義昌蓮合稱為中國四大蓮子。湘蓮可被分為三大類別，分別為“寸三蓮”、雜交芙蓉蓮和“太空蓮”，其中，以富含蛋白質(zhì)但脂肪含量較低的寸三蓮的質(zhì)量最佳。且根據(jù)武漢商檢局將寸三蓮與建白蓮、贛白蓮以及湖蓮進行的營養(yǎng)成分對比分析結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，寸三蓮在糖類化合物、蛋白質(zhì)、脂肪以及鈣、磷等含量上高于其他蓮種，這也進一步佐證了寸三蓮的優(yōu)越性。而且湘蓮蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值也十分高，其含有較多的賴氨酸，可以彌補賴氨酸在谷類蛋白質(zhì)中的缺乏，同時還包含很多糧作物中所缺失的組氨酸、精氨酸和酪氨酸，對兒童生長發(fā)育具有重大作用。然而，長期以來，我國對于湘蓮產(chǎn)品的深加工只是停留在通心蓮、糖水蓮子罐頭、蜜餞、蓮蓉等簡單工藝上，雖然劉忠義等以湘蓮作為輔料、配以固體乳和奶油，研制出了營養(yǎng)價值高的湘蓮冰淇淋，但關(guān)于湘蓮蛋白質(zhì)的產(chǎn)品開發(fā)力度不夠。因此，進一步研究提取湘蓮蛋白質(zhì)及其綜合應(yīng)用具有重要意義。

目前國內(nèi)外研究較多的提取蛋白質(zhì)的方法有堿溶酸析、酶解提取、堿法提取、鹽溶酸沉、超聲提取、水酶法等，其中，酶法反應(yīng)條件溫和、提取時間短且可以較大程度地保留蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。根據(jù)趙東海等在對比分析酸性、中性、堿性三種蛋白酶對米糠蛋白提取的效果中發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶的提取效果最好，說明堿性蛋白酶具有較高的酶活力和酶穩(wěn)定性。本試驗對堿性蛋白酶法提取湘蓮蛋白質(zhì)進行了單因素分析，并應(yīng)用正交試驗優(yōu)化確定提取湘蓮蛋白的最佳工藝方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

通心湘蓮：購于湖南宏興隆湘蓮食品有限公司；堿性蛋白酶：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司（酶活力>200U/mg）；乙醇、濃硫酸、硼酸、氫氧化鈉均是分析純。

1.2儀器與設(shè)備

ZN-400A型高速中藥粉碎機，長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠；K-S28型電熱恒溫水浴鍋，上海精密試驗設(shè)備公司；DD5型大容量多管離心機，長沙英泰儀器有限公司；島津AUY220分析天平（0.000 1g）；KDN-103F自動凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；PH5-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1湘蓮蛋白質(zhì)提取方法

將通心湘蓮干燥后進行粉碎、過100目篩，于4℃下保存。每次精準(zhǔn)稱取5g蓮粉，放于250mL干燥的三角瓶，按一定的液料比加入蒸餾水后調(diào)節(jié)pH為8，加入堿性蛋白酶，搖勻，在一定溫度和時間下提取湘蓮蛋白質(zhì)，提取完成后于80%下水浴15min，以達到滅酶效果，而后在5 000r/min的速度下將液料混合物離心15min。測定上清液體積和蛋白質(zhì)含量，根據(jù)公式計算出湘蓮蛋白的提取率。

1.3.2單因素試驗

（1）固定酶用量為1.2%，提取溫度為55℃，提取時間為2h，加入不同的液料比（5：1、10：1、15：1、20：1、25：1），討論液料比對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響，并確定最佳液料比。

（2）固定酶用量為1.2%，液料比為15：1，提取時間為2h，設(shè)定不同的提取溫度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃），討論溫度對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響，并確定最佳提取溫度。

（3）固定酶用量為1.2%，液料比為15：1，提取溫度為55℃，設(shè)定不同的提取時間（1h、1.5h、2h、2.5h、3h），討論提取時間對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響，并確定最佳提取時間。

（4）固定液料比為15：1、提取溫度為55℃、提取時間為2h，加入不同的酶用量（0.5%、1%、1.2%、1.8%、2%），討論酶用量對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響，并確定最佳酶用量。

1.3.3正交試驗設(shè)計

結(jié)合單因素試驗，選取液料比、提取溫度、提取時間、酶用量四項要素進行4因素3水平的正交試驗，因素水平如表1。

1.3.4測定方法

湘蓮粗蛋白的測定：GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法。

2結(jié)果與分析

2.1蓮子總蛋白含量

經(jīng)試驗測得，湘蓮中總蛋白質(zhì)含量為16.74%。

2.2單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1酶用量對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響

如圖1所示，湘蓮蛋白質(zhì)的提取率在隨著堿性蛋白酶用量的增加而不斷提高?？赡苁怯捎诿傅牟粩嘣黾樱岣吡瞬蝗苄缘鞍椎娜艹?。但當(dāng)堿性蛋白酶的用量到達1.8%后，其增加幅度趨于平緩，這是因為各種酶在特定蛋白質(zhì)分子上的作用位點數(shù)目是一定的，當(dāng)酶用量到達一定水平后，酶與底物作用達到飽和，再提高酶用量并不能顯著加快酶促反應(yīng)。因此綜合考慮蛋白質(zhì)提取效果和酶成本后，選取1.8%為最佳酶用量。

2.2.2液料比對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響

如圖2所示，蛋白質(zhì)的提取率受液料比的影響較為明顯。當(dāng)加入的液料比小于20：1時，湘蓮蛋白質(zhì)的提取程度伴隨液料比的增大而出現(xiàn)大幅度的增加趨勢。這可能是由于加入的液體增大了酶和底物的流動性，使得酶與底物相互作用接觸的機率更大。但當(dāng)加入25：1的液料比時，堿性蛋白酶和底物都被稀釋，反應(yīng)速率降低，因而湘蓮蛋白質(zhì)的提取程度下降。對于工業(yè)生產(chǎn)而言，液料比的增大，不僅造成大量水消耗和增加廢水排出量，也會對后期的干燥濃縮程序產(chǎn)生負(fù)擔(dān)，因此，選取液料比20：1為最佳條件。

2.2.3提取時間對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響

如圖3所示，提取時間設(shè)定為1h時，被提取的湘蓮蛋白質(zhì)較少，可能是因為蓮子粉本身需要一定時間溶脹。延遲提取時間至1.5h和2h后，蛋白質(zhì)的提取率與提取1h的結(jié)果相比，都有較大的提升。這可能是因為提取時間的增長給予更多蛋白質(zhì)溶出的機會，從而使蛋白提取率得到提高，2h時提取效果最好，提取率達至87%。若持續(xù)增長提取時間，酶的活力開始降低，底物也在減少，同時因為酶與底物作用飽和后，酶將會有更多的機會作用于已經(jīng)溶出的蛋白質(zhì)或者多肽，導(dǎo)致蛋白質(zhì)被進一步被水解為氨基酸等小分子，提取率開始呈下降趨勢。因此，選取2h為最佳提取時間。

2.2.4提取溫度對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響

如圖4所示，湘蓮蛋白提取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先緩慢上升后下降的趨勢。當(dāng)溫度在45-60℃范圍內(nèi)逐漸升高時，湘蓮蛋白質(zhì)的提取率在小幅度增加，因為適當(dāng)加大溫度，可以增強堿性蛋白酶的活力，從而提高酶促反應(yīng)速率。當(dāng)溫度升至65℃時，蛋白質(zhì)的提取程度明顯下降，結(jié)合曾紹校對蓮子淀粉糊化動力學(xué)的研究結(jié)果：蓮子淀粉在64.4下開始糊化，推測蛋白質(zhì)提取率下降的原因可能是部分淀粉糊化影響了蛋白質(zhì)的提取，還有可能是因為較高的溫度影響了堿性蛋白酶的活性，降低了其提取蛋白質(zhì)的能力。由于在50-60℃的溫度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的提取率相差不大，考慮到部分蛋白質(zhì)可能因為溫度較高而發(fā)生變質(zhì)，所以從節(jié)約能源和保持蛋白質(zhì)功能特性等方面出發(fā)，選擇50%為最佳提取溫度。

2.3正交試驗結(jié)果與分析

以單因素試驗為基礎(chǔ)，進行堿性蛋白酶提取法正交優(yōu)化試驗，選取液料比（V/W）、提取溫度（℃）、提取時間（h）、酶用量（%）為試驗因素作四因素三水平正交試驗，結(jié)果如表2所示。

由表2的極差分析結(jié)果可知，各要素對湘蓮蛋白質(zhì)提取率的影響程度大小順序為A>C>D>B，即液料比>提取時間>酶含量>提取溫度，其優(yōu)化提取工藝條件為A3C2D383，經(jīng)驗證試驗，其湘蓮蛋白質(zhì)的提取率為92.01%，低于正交試驗中的最優(yōu)試驗組合A3C2D381。所以，堿性蛋白酶法提取湘蓮蛋白質(zhì)的優(yōu)化提取工藝取A3C2D381，即在液料比為20：1的條件下，加入1.8%的堿性蛋白酶，50%下提取2h，湘蓮蛋白質(zhì)的提取率為92.61%。

3結(jié)論

在用堿性蛋白酶法提取湘蓮蛋白質(zhì)時，各因素對湘蓮蛋白提取程度的影響力大小依次是：液料比>提取時間>酶含量>提取溫度。即液料比的影響力最大，提取溫度的影響程度最小。并確定堿性蛋白酶法提取湘蓮蛋白質(zhì)的最佳方法為，在液料比為20：1的條件下，加入1.8%的堿性蛋白酶，在50℃下提取2h，湘蓮蛋白質(zhì)的提取率可達92.61%。