尚瑩瑩 胡輝 劉源才

摘 要 目的：優(yōu)化金櫻子配方顆粒的提取工藝，并初步建立該配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及指紋圖譜。方法：以金櫻子藥材出膏率和金櫻子多糖提取率為指標(biāo)，以提取次數(shù)、加水量和提取時(shí)間為因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化金櫻子配方顆粒的提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。采用薄層色譜法（TLC）對(duì)金櫻子配方顆粒進(jìn)行定性鑒別；采用紫外分光光度法（UV）對(duì)金櫻子配方顆粒中的金櫻子多糖（以D-無水葡萄糖計(jì)）進(jìn)行含量測(cè)定。采用高效液相色譜法（HPLC）建立金櫻子配方顆粒的指紋圖譜；以8號(hào)峰為參照，繪制10批金櫻子配方顆粒樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰。結(jié)果：優(yōu)選提取工藝為8倍量水，回流提取2次，每次2 h；金櫻子藥材平均出膏率為51.07%（RSD=0.58%，n=3）、金櫻子多糖平均提取率為22.17%（RSD=0.58%，n=3）。金櫻子配方顆粒樣品TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好。UV法測(cè)定D-無水葡萄糖檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.010 8～0.054 2 mg/mL（r=0.999 1）；金櫻子多糖定量限為0.070 3 mg，檢測(cè)限為0.014 0 mg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%；加樣回收率為97.3%～100.8%（RSD=1.33%，n=9）。10批金櫻子配方顆粒樣品的HPLC圖譜有8個(gè)共有峰，相似度均大于0.937；經(jīng)驗(yàn)證，該10批金櫻子配方顆粒樣品的HPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：金櫻子配方顆粒的優(yōu)化提取工藝穩(wěn)定、可行；所建的指紋圖譜可為金櫻子配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 金櫻子；配方顆粒；提取工藝；正交試驗(yàn)；薄層色譜法；紫外分光光度法；高效液相色譜法；含量測(cè)定；指紋圖譜

中圖分類號(hào) R944；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）14-1922-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.12

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology and establish the quality standard and fingerprint of Rosa laevigata formula granules primarily. METHODS： Using the yield of extract and extract rate of R. laevigata polysaccharide as index， the extraction technology of R. laevigata formula granules was optimized by orthogonal test with water amount， extraction times and extracting time as factors. Validation test was also conducted. TLC was used to identity R. laevigata formula granule qualitatively. The content of R. laevigata polysaccharide （by D-glucosum anhydricum） in R. laevigata formula granules was determined quantitatively by UV spectrophotometry. HPLC method was adopted to establish the fingerprint of R. laevigata formula granules. Using No. 8 peak as reference， HPLC chromatograms of 10 batches of R. laevigata formula granules were drawn. The similarity of samples was evaluated by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition） to determine common peak. RESULTS： The optimal extraction technology was as follows as 8-fold water， extracting for 2 times， 2 h each time. The average yield was 51.07% （RSD=0.58%，n=3） and the average extraction rate of polysaccharide in R. laevigata was 22.17% （RSD=0.58%，n=3）. TLC spots of R. laevigata formula granules were clear and well-separated. In UV test， the linear range of D-glucosum anhydricum were 0.010 8-0.054 2 mg/mL （r=0.999 1）， respectively； for R. laevigata polysaccharide， the limit of quantitation was 0.070 3 mg， and the limit of detection was 0.014 0 mg； RSDs of precision， stability and reproducibility tests were lower than 2%； average recoveries were 97.3%-100.8% （RSD=1.33%，n=9）. There were 8 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples， and the similarity was higher than 0.937. After validation， HPLC chromatograms of 10 batches of sample had good consistency with reference fingerprints. CONCLUSIONS： The optimized extraction technology of R. laevigata formula granules is stable. Established fingerprint can provide reference for quality evaluation of R. laevigata formula granules.

KEYWORDS Rosa laevigata； Formula granules； Extraction technology； Orthogonal test； TLC； UV spectrophotometry； HPLC； Content determination； Fingerprint

金櫻子為薔薇科植物金櫻子（Rosa laevigata Michx.）的干燥成熟果實(shí)。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）將金櫻子收載為常用中藥，其具有固精縮尿、固崩止帶、澀腸止瀉等功效[1]，臨床常用于治療上呼吸道感染、燒傷、直腸脫垂及各種婦科疾病[2]。金櫻子富含多糖、黃酮及鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分[3-6]。中藥配方顆粒是對(duì)傳統(tǒng)中藥材應(yīng)用形式的重大突破，其以生產(chǎn)自動(dòng)化、生產(chǎn)條件恒定等特點(diǎn)，既符合中醫(yī)辨證論治原則，又具有免煎易服、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[7-9]。本研究?jī)?yōu)化了金櫻子配方顆粒的提取工藝，并采用薄層色譜法（TLC）對(duì)金櫻子配方顆粒進(jìn)行定性鑒別，采用紫外分光光度法（UV）對(duì)金櫻子飲片、提取物、配方顆粒中的金櫻子多糖（以D-無水葡萄糖計(jì)）進(jìn)行含量測(cè)定，同時(shí)，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了金櫻子配方顆粒的指紋圖譜，旨在為該配方顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

U3000型HPLC儀，包括LPG-3400SDN四元梯度泵、WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000RS柱溫箱、VWD-3100及DAD-3000檢測(cè)器（德國(guó)Thermo Fisher公司）；T9型UV儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SK8200LHC型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；AB135-S型電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]；ELGA Option-Q型純水機(jī)[威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

金櫻子配方顆粒（勁牌生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)： P20161115、P20161116、P20161117、P20161118、P20161119、P20161121、P20161123、P20161124、P20161126、P20161127，規(guī)格：2.6 g/袋，每1 g金櫻子配方顆粒相當(dāng)于3.8 g金櫻子中藥飲片）；金櫻子對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121047-201204）；D-無水葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201506，純度：99.9%）；麥芽糊精（西王藥業(yè)有限公司，批號(hào)：F160305004）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

金櫻子藥材（湖北正光九資河藥業(yè)有限公司，批號(hào)：160601），經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院梅之南教授鑒定為薔薇科植物金櫻子（Rosa laevigata Michx.）的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 金櫻子配方顆粒提取工藝優(yōu)化

2.1.1 正交試驗(yàn)因素與水平 參考《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》[10]中的規(guī)定，以提取次數(shù)（A）、加水量（B）和提取時(shí)間（C）為因素，以金櫻子藥材出膏率和金櫻子多糖提取率為指標(biāo)，每個(gè)因素取3個(gè)不同水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行考察。因素與水平見表1。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 稱取金櫻子藥材20 g，共9份，按“2.4”項(xiàng)下UV法測(cè)定金櫻子多糖的含量，并計(jì)算金櫻子藥材出膏率和金櫻子多糖提取率。金櫻子藥材出膏率（%）=干膏粉質(zhì)量（g）/提取用生藥質(zhì)量（g）×100%；金櫻子多糖提取率（%）=干膏粉質(zhì)量（g）×金櫻子多糖含量（%）/提取用生藥質(zhì)量（g）×100%，或金櫻子多糖提取率（%）=金櫻子藥材出膏率（%）×金櫻子多糖含量（%）。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。采用方差分析方法對(duì)金櫻子多糖提取率進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

2.1.3 優(yōu)選的提取工藝 由方差分析結(jié)果可知，影響金櫻子多糖提取率的因素影響程度依次為C>A>B，其中因素C有顯著影響，即提取時(shí)間是影響該工藝的最重要因素。從省時(shí)降耗及生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，在保證提取充分的前提下，綜合分析各個(gè)因素的影響，擬定優(yōu)選提取工藝為A2B1C3，即8倍量水，回流提取2次，每次2 h。

2.1.4 優(yōu)選提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取金櫻子藥材200 g，按優(yōu)選提取工藝重復(fù)驗(yàn)證3次，測(cè)得金櫻子藥材平均出膏率為51.07%，RSD為0.58%（n=3）；金櫻子多糖平均提取率為22.17%，RSD為0.58%（n=3），表明該優(yōu)選工藝可靠，結(jié)果見表4。

2.2 金櫻子配方顆粒的制備

以優(yōu)選的提取工藝，精密稱取金櫻子藥材2 kg，共10份，分別加入8倍量水，回流提取2次，每次2 h；合并提取液，濾過，濾液蒸干得金櫻子浸膏；加8%麥芽糊精，干法（擠壓制粒法）制粒，干燥，得金櫻子配方顆粒。

2.3 金櫻子配方顆粒的定性鑒別

精密稱取金櫻子配方顆粒樣品（批號(hào)：P20161115）粉末2 g，加乙醇30 mL，超聲（功率：500 W，頻率：53 kHz，下同）處理30 min，濾過；濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL；合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取金櫻子對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。以甲醇溶液作為陰性對(duì)照溶液。按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[10-11]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1。

2.4 UV法測(cè)定金櫻子配方顆粒中金櫻子多糖的含量

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取于105 ℃下干燥至恒質(zhì)量的D-無水葡萄糖對(duì)照品10.84 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.084 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取金櫻子配方顆粒樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加水50 mL，稱定質(zhì)量，靜置1 h，加熱回流1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液1 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取25 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 以4%苯酚-硫酸為空白，取“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，于200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果最大吸收波長(zhǎng)為490 nm，詳見圖2。

2.4.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得系列對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述系列對(duì)照品貯備液2 mL，置于具塞試管中，加4%苯酚溶液1 mL，混勻，后迅速精密加入硫酸7 mL，搖勻，置于40 ℃水浴中保溫30 min，取出，置于冰水浴中放置5 min，得系列線性工作溶液。分別精密吸取上述系列線性工作溶液適量，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得D-無水葡萄糖的回歸方程為y=10.325x+0.146 4（r=0.999 1）。結(jié)果表明，D-無水葡萄糖檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.010 8～0.054 2 mg/mL。

2.4.5 定量限與檢測(cè)限考察 精密吸取“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。分別按信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，金櫻子多糖的定量限為0.070 3 mg，檢測(cè)限為0.014 0 mg。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，置于具塞試管中，按“2.4.4”項(xiàng)下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，于490 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果，金櫻子多糖吸光度的RSD為1.21%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)： P20161115）2 mL，共6份，置于25 mL具塞比色管中，按“2.4.4”項(xiàng)下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，分別于顯色0、2、4、8、12、24 h后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，金櫻子多糖吸光度的RSD為1.03%（n=6），表明供試品溶液經(jīng)顯色后24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取金櫻子配方顆粒樣品（批號(hào)： P20161115）粉末共6份，每份0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取2 mL，置于具塞錐形瓶中，再按“2.4.4”項(xiàng)下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，金櫻子多糖吸光度的RSD為1.60%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn) 取金櫻子配方顆粒樣品（批號(hào)： P20161115）粉末共9份，每份0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，加入一定量的對(duì)照品溶液。分別精密量取2 mL，置于具塞試管中，按“2.4.4”項(xiàng)下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

2.4.10 樣品含量測(cè)定 取10批金櫻子配方顆粒樣品各適量，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密量取2 mL，置于具塞試管中，按“2.4.4”項(xiàng)下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表6。含量限度按測(cè)定結(jié)果平均值的80%計(jì)算，得金櫻子多糖含量不得少于34.73%。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Thermo C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表7）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：10 ?L；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min[11-14]。

2.5.2 供試品溶液的制備 取金櫻子配方顆粒樣品粉末約0.1 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加20%甲醇超聲溶解30 min并定容，混勻，經(jīng)0.22 ?m針頭過濾器濾過，即得。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.5.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：P20161116）適量，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以8號(hào)峰為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，8個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：P20161116）共7份，分別于30 ℃下放置1、3、5、7、14、21、28 h時(shí)按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以8號(hào)峰為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，8個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=7），表明供試品溶液于30 ℃下放置28 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取金櫻子配方顆粒樣品（批號(hào)：P20161116）粉末適量，共6份，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以8號(hào)峰為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，8個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.6 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰的相關(guān)分析 （1）HPLC指紋圖譜的生成。取10批金櫻子配方顆粒樣品各適量，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批金櫻子配方顆粒樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖3、圖4。

（2）相似度分析。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）以樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜為參照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批樣品相似度均大于0.937，表明各批金櫻子配方顆粒具有良好的穩(wěn)定性和特征性，擬定金櫻子配方顆粒指紋圖譜相似度應(yīng)不得低于0.900，詳見表8。

（3）共有峰的相關(guān)分析。10批金櫻子配方顆粒樣品有8個(gè)共有峰，其中8號(hào)峰含量最高（但筆者尚未對(duì)8號(hào)峰的具體成分進(jìn)行研究），因此選擇保留時(shí)間為46.732 min的8號(hào)峰為參考峰，并計(jì)算其他峰相對(duì)于8號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見表9、表10。

3 討論

本研究采用正交試驗(yàn)法對(duì)金櫻子配方顆粒的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并確定優(yōu)選提取工藝為8倍量水，回流提取2次，每次2 h。采用該工藝得到金櫻子藥材平均出膏率為51.07%，金櫻子多糖平均提取率為22.17%，表明該工藝高效、穩(wěn)定、可靠，可為金櫻子配方顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]，采用TLC法對(duì)金櫻子配方顆粒進(jìn)行定性鑒別，結(jié)果表明，樣品TLC圖斑點(diǎn)清晰、分離度好。采用UV法對(duì)金櫻子配方顆粒中的金櫻子多糖進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明，該方法針對(duì)性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確。另外，本研究建立了金櫻子配方顆粒的HPLC指紋圖譜，結(jié)果10批樣品有8個(gè)共有峰，相似度均大于0.937，表明樣品的HPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。

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（收稿日期：2018-02-27 修回日期：2018-05-18）

（編輯：陳 宏）