劉雪瑩 趙雨 何慧楠 李雪惠 劉莉 齊濱

摘 要 目的：建立同時測定梅花鹿鹿茸藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷 5 種核苷類成分含量的方法，并比較不同產(chǎn)地梅花鹿鹿茸藥材中上述核苷類成分含量的差異。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18，流動相為甲醇-0.07%冰醋酸溶液（4 ∶ 96，V/V），流速為1.0 mL/min， 檢測波長為254 nm，柱溫為28 ℃，進樣量為5 μL。采用SPSS 19.0軟件對30批不同產(chǎn)地梅花鹿鹿茸藥材（S1～S30）進行聚類分析。結(jié)果：尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的檢測質(zhì)量濃度線性范圍均為0.001～0.01 mg/mL（r均為0.999 9）；定量限分別為1.489 1、1.927 9、4.880 9、7.884 6、8.092 1 ng，檢測限分別為0.446 7、0.578 4、1.464 3、2.365 4、2.427 7 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于2%；加樣回收率分別為99.69%～103.65%（RSD=1.40%，n=9）、97.77%～103.26%（RSD=1.67%，n=9）、97.82%～101.81%（RSD=1.12%，n=9）、99.30%～104.82%（RSD=1.72%，n=9）、98.13%～100.20%（RSD=0.64%，n=9）。30批藥材樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的含量存在差異。上述藥材樣品可聚為3大類，即S16～S18、S22～S30聚為一類，S8～S15、S19～S21聚為一類，S1～S7聚為一類。結(jié)論：該方法精密度、穩(wěn)定性、重復性均較好，可用于同時測定梅花鹿鹿茸藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的含量；梅花鹿鹿茸藥材的質(zhì)量受生態(tài)環(huán)境、養(yǎng)殖技術(shù)等因素的影響，存在較大差異。

關(guān)鍵詞 梅花鹿鹿茸；尿嘧啶；次黃嘌呤；尿苷；肌苷；鳥苷；高效液相色譜法；含量測定；聚類分析

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1945-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.17

ABSTRACT OBJECTIVE： To set up a method for simultaneous determination of 5 nucleosides as uracil， hypoxanthine， uridine， creatinine and guanosine in Cervus nippon， to compare the differences of above nucleosides content in C. nippon among different producing areas. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Aglient Eclipse Plus C18 column with methanol-0.07% glacial acetic acid （4 ∶ 96，V/V） as mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 254 nm. The column temperature was set at 28 ℃， and sample size was 5 ?L. Cluster analysis was conducted for 30 batches of C. nippon from different producing areas by using SPSS 19.0 software. RESULTS： The linear ranges of uracil， hypoxanthine， uridine， creatinine and guanosine were 0.001-0.01 mg/mL （all r≥0.999 9）. The limits of quantitation were 1.489 1， 1.927 9， 4.880 9， 7.884 6， 8.092 1 ng， and the limits of detection were 0.446 7， 0.578 4， 1.464 3， 2.365 4， 2.427 7 ng， respectively. RSDs of precision， stability， reproducibility tests were lower than 2%. The recoveries were 99.69%-103.65%（RSD=1.40%，n=9），97.77%-103.25%（RSD=1.67%，n=9）， 97.82%-101.81%（RSD=1.12%， n=9）， 99.30%-104.82%（RSD=1.72%，n=9） and 98.13%-100.20%（RSD=0.64%，n=9）. The contents of uracil， hypoxanthine， uridine， creatinine and guanosine were significantly different in 30 batches of C. nippon， which were clustered into 3 categories. S16-S18 and S22-S30 were clustered into one category； S8-S15 and S19-S21 were clustered into one category； S1-S7 were clustered into one category. CONCLUSIONS： The method has good precision， stability and reproducibility. It is suitable for simultaneous determination of uracil， hypoxanthine， uridine， creatinine and guanosine in C. nippon. The quality of C. nippon has great difference due to ecological environment and technical factors of farming.

KEYWORDS Cervus nippon； Uracil； Hypoxanthine； Uridine； Creatinine； Guanosine； HPLC； Content determination； Cluster analysis

鹿茸為鹿科動物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或馬鹿（Cervus elaphus Linnaeus）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。梅花鹿鹿茸因具有改善神經(jīng)功能及性功能障礙，抗疲勞、抗衰老、抗氧化等藥理作用[2-3]，而奠定了其在醫(yī)藥及保健領(lǐng)域的地位。 目前，梅花鹿鹿茸的藥效成分未明確，在加工、質(zhì)量評定、真?zhèn)舞b別等工作中，缺少以化學成分作為指標的科學標準，因而制約了其深入開發(fā)與利用。

相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國市場上的鹿茸藥材約有 80%產(chǎn)于梅花鹿[4]。由于受藥材來源、生態(tài)環(huán)境、市場供需等因素的影響，使大量的梅花鹿鹿茸易混品與偽品流入了藥材市場，因此建立全面、系統(tǒng)地控制梅花鹿鹿茸藥材質(zhì)量的分析方法十分必要。鹿茸中主要含有脂類、多糖、多胺、蛋白質(zhì)及多肽、激素樣物質(zhì)、生物堿類、核苷類等多種化學成分[5-7]。鹿茸中核苷類成分是抗衰老的主要成分之一，包括尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷等。有研究表明，次黃嘌呤可抑制與神經(jīng)系統(tǒng)老化有關(guān)的單胺氧化酶的活性，從而發(fā)揮抗氧化及抗衰老的作用[8]；核苷類成分具有調(diào)節(jié)免疫功能、促進腸道修復、降血壓、抗心律失常、抗缺血性損傷、保肝、鎮(zhèn)靜等生物活性[9]。因此，該類成分與鹿茸的生物活性有一定的關(guān)聯(lián)，可作為鹿茸藥材的質(zhì)量評價指標之一。而目前，對不同產(chǎn)地的梅花鹿鹿茸藥材中核苷類成分的系統(tǒng)研究尚未見報道。為此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定了14個?。▍^(qū)）的30批梅花鹿鹿茸藥材樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷5種核苷類成分的含量，并通過聚類分析比較了不同產(chǎn)地藥材樣品的含量差異，從而為篩選優(yōu)良種質(zhì)資源、規(guī)范養(yǎng)殖和制訂相關(guān)質(zhì)量標準提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030型HPLC儀，包括四元泵、真空脫氣機、自動進樣器、紫外-可見光檢測器、柱溫箱、色譜工作站 （日本島津公司）；DZF-6050型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；Eppendorf 5920R型低速離心機（德國艾本德公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； MS204S 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑

尿嘧啶對照品（批號：140669-201305）、肌苷對照品（批號：100469-201302）均由中國食品藥品檢定研究院提供；次黃嘌呤對照品（批號：B20211）、尿苷對照品（批號：B20907）、鳥苷對照品（批號：B20905）均由上海源葉生物科技有限公司提供，經(jīng) HPLC 峰面積歸一化法計算純度均不低于98%；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

梅花鹿鹿茸藥材樣品（編號：S1～S30）經(jīng)長春中醫(yī)藥大學藥學院姜大成教授鑒定為鹿科動物梅花鹿（C. nippon Temminck）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。藥材樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動相：甲醇-0.07%冰醋酸溶液（4 ∶ 96，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：28 ℃；進樣量：5 μL。在該色譜條件下，理論板數(shù)以次黃嘌呤峰計應不低于10 000，分離度均大于1.5，陰性對照對測定無干擾，詳見圖 1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取尿嘧啶對照品、次黃嘌呤對照品、尿苷對照品、肌苷對照品、鳥苷對照品各5 mg，置于50 mL量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，得單一對照品溶液。精密量取上述單一對照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加水定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得各成分質(zhì)量濃度均為0.01 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取干燥的藥材樣品細粉（過四號篩）0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加水7.5 mL，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）提取30 min后，10 000 r/min離心10 min，分離提取液后，殘渣再超聲提取1次。 合并2次提取液，置于50 mL量瓶中，加水定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 以4%甲醇為陰性對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分檢測質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

2.4 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。按信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的定量限分別為1.489 1、1.927 9、4.880 9、7.884 6、8.092 1 ng，檢測限分別為0.446 7、0.578 4、1.464 3、2.365 4、2.427 7 ng。

2.5 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷峰面積的RSD 分別為0.06%、0.06%、0.08%、0.09%、0.09%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S6）適量，分別于室溫下放置0、2、6、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷峰面積的RSD 分別為0.09%、0.30%、0.21%、0.18%、0.31%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取藥材樣品（編號：S6）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷含量的RSD分別為0.65%、0.45%、0.72%、1.13%、0.87%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量藥材樣品（編號：S6）細粉約0.50 g，共 9 份，精密稱定，加入一定量的各單一對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測定

取30批藥材樣品細粉各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按 “2.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4。

2.10 聚類分析

采用 SPSS 19.0軟件對藥材樣品進行聚類分析。采用離差平方和法，以平方歐式距離為區(qū)間進行聚類，結(jié)果見圖2；各大類樣品中5種核苷類成分平均含量見表5。由圖2、表5可知， 30 批藥材樣品可聚為3大類： S16～S18、S22～S30聚為一類，此類藥材樣品中5 種核苷類成分的含量均小于總體平均值；S8～S15、S19～S21聚為一類，此類藥材樣品中5 種核苷類成分的含量與總體平均值相差不大；S1～S7聚為一類，此類藥材樣品中尿嘧啶、尿苷含量明顯高于總體平均值，其他核苷類成分含量略高于總體平均值。這提示，不同產(chǎn)地的藥材樣品中5種核苷類成分含量存在差異，其中以S1～S7藥材樣品中核苷類成分含量最高。

3 討論

在預試驗中，筆者通過比較超聲、回流、振蕩3種提取方法，發(fā)現(xiàn)超聲法提取率最高，最終選擇以超聲法提取樣品。通過比較不同溶劑（甲醇、乙醇、水），發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇為溶劑時最大吸收峰峰形欠佳，故選擇以水為提取溶劑。通過比較不同溶劑用量（10、15、20倍），發(fā)現(xiàn)15倍水提取時提取率最高且不再增加，故選擇溶劑用量為15倍水。通過比較不同提取時間（30、45、60 min）、提取次數(shù)（2、3、4次），發(fā)現(xiàn)提取時間30 min、提取3次的提取率最高，故選擇提取時間30 min、提取次數(shù)3次。

在預試驗中，通過對不同色譜柱Agilent TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Aglient Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、島津ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行比較，發(fā)現(xiàn)采用Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）對5種核苷類成分均可達到良好的分離。通過以甲醇-水、乙腈-水為流動相進行比較，發(fā)現(xiàn)流動相為甲醇-水（4 ∶ 96，V/V）時次黃嘌呤與尿苷色譜峰不能較好地分離；又嘗試加入不同比例的冰醋酸，發(fā)現(xiàn)加入0.07%冰醋酸后，峰形得到改善，可實現(xiàn)5種核苷類成分色譜峰均較好地分離。確定檢測波長為254 nm、柱溫為28 ℃時，嘗試對不同流速（1.0、0.8、0.5 mL/min）進行比較，發(fā)現(xiàn)當流速為1 mL/min時，5種核苷類成分能在20 min內(nèi)快速分離。確定流速1 mL/min、檢測波長254 nm時，嘗試對不同柱溫（28、30、35 ℃）進行比較，發(fā)現(xiàn)當柱溫為28、35 ℃時，出峰時間均較快，故選擇柱溫28 ℃。

本研究結(jié)果顯示，5種核苷類成分含量以吉林地區(qū)和黑龍江地區(qū)藥材樣品最高，其他?。▍^(qū)）藥材樣品中上述核苷類成分的含量相對較低，但同一地區(qū)的藥材樣品中上述核苷類成分含量差別不大。這可能與梅花鹿養(yǎng)殖技術(shù)和當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境有關(guān)。

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（收稿日期：2018-01-31 修回日期：2018-05-21）

（編輯：陳 宏）