沐宇 姬懷雪 胡書群 高杏 杜秀平 何偉平 吳如夢(mèng) 王艷

中圖分類號(hào) R968；R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）12-1648-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.15

摘 要 目的：探討DNA修復(fù)基因X線損傷修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（XRCC1）rs25487位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌發(fā)生的相關(guān)性。方法：選取2015年9月-2016年7月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的蘇北地區(qū)漢族原發(fā)性肺癌患者208例，作為肺癌組；選擇同期于該院進(jìn)行體檢的健康志愿者214例，作為對(duì)照組。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法檢測各受試者XRCC1基因rs25487位點(diǎn)的基因型，采用Logistic回歸模型評(píng)價(jià)各基因型與肺癌發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果：兩組受試者的年齡及性別分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而肺癌組吸煙者的比例顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。共檢出XRCC1基因rs25487位點(diǎn)AA、AG、GG 3種基因型。其中，對(duì)照組受試者AA、AG、GG型頻率分別為43.5%、41.1%、15.4%，肺癌組患者上述基因型頻率分別為28.8%、48.6%、22.6%，兩組受試者各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），但其基因型分布組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與AA型個(gè)體比較，AG型個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.265倍[比值比（OR）=2.265，95%置信區(qū)間（CI）（1.299，3.950），P=0.040；經(jīng)年齡、性別、吸煙史校正的OR=2.309，95%CI（1.274，4.185），P=0.006]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GG型個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了1.310倍[OR=1.310，95%CI（0.771，2.228），P=0.318；經(jīng)校正的OR=1.429，95%CI（0.811，2.518），P=0.217]，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：XRCC1基因rs25487位點(diǎn)突變雜合是我國蘇北地區(qū)漢族人群發(fā)生肺癌的危險(xiǎn)因素，且吸煙可以增加肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞 XRCC1基因；rs25487位點(diǎn)；單核苷酸多態(tài)性；肺癌；發(fā)生；相關(guān)性

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the correlation of XRCC1 rs25487 polymorphism with the occurrence of lung cancer. METHODS： A total of 208 patients with primary lung cancer of Han nationality in Northern Jiangsu selected from the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University during Sept. 2015-Jul. 2016 were included in lung cancer group. A total of 214 healthy volunteers of the hospital underwent physical examination were included in control group. PCR-RFLP was used to detect the genotypes at XRCC1 rs25487 locus， and Logistic regression model was used to evaluate the correlation of genotypes with the occurrence of lung cancer. RESULTS： There was no statistical significance in the distribution of age and gender between 2 groups （P>0.05）. The proportion of smoker in lung cancer group was significantly higher than control group， with statistical significance （P<0.05）. AA， AG and GG genotypes were detected at rs25487 locus of XRCC1 gene. The frequency of AA， AG and GG genotype were 43.5%， 41.1% and 15.4% in control group and 28.8%， 48.6% and 22.6% in lung cancer group， respectively. The frequencies of genotypes in 2 groups were in line with Hardy-Weinberg equilibrium （P>0.05）， but there was statistical significance in genotype distribution between 2 groups（P<0.05）. Compared with AA genotype， the risk of lung cancer in individuals carrying AG genotype increased by 2.265 fold [OR=2.265， 95%CI（1.299， 3.950），P=0.040； after corrected with gender， age and smoking history OR=2.309，95%CI（1.274，4.185），P=0.006]， with statistical significance. The risk of lung cancer in individuals carrying GG genotype increased by 1.310 fold [OR=1.310，95%CI（0.771，2.228），P=0.318；after corrected OR=1.429，95%CI（0.811，2.518），P=0.217]， without statistical significance. CONCLUSIONS：rs25487 locus mutant heterozy- gosity of XRCC1 gene is risk factor of lung cancer in Han nationality from Northern Jiangsu， and smoking can increase the risk of lung cancer.

KEYWORDS XRCC1 gene； rs25487； Single nucleotide polymorphism； Lung cancer； Occurrence； Relationship

肺癌是我國惡性腫瘤致死的首要原因，暴露環(huán)境危險(xiǎn)因素與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。但暴露在相同環(huán)境中，不同個(gè)體發(fā)生肺癌的概率仍存在很大差異[2]。相關(guān)研究表明，遺傳因素是增加肺癌易感性的重要原因之一[2]。其中，單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是最常見的遺傳學(xué)改變，DNA修復(fù)基因的SNP可影響個(gè)體對(duì)肺癌的易感性[3]。肺癌的發(fā)生與內(nèi)、外源性致癌因子引起的DNA損傷密不可分，DNA修復(fù)基因的SNP作為個(gè)體DNA修復(fù)能力（DNA repair capacity，DRC）差異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，可能是影響肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的重要遺傳因素[4]。X射線損傷修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（X-ray repair cross complementing gene 1，XRCC1）是堿基切除修復(fù)（Base excision repair，BER）途徑上的關(guān)鍵基因，其編碼的蛋白與DNA聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ一起參與BER過程[5]。盡管XRCC1基因rs25487位點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)，但因研究群體、種族等差異，結(jié)論尚存在很大分歧[6-9]。為此，本研究以我國蘇北地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，探討其XRCC1基因rs25487位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌發(fā)生的相關(guān)性，以期為肺癌的預(yù)防和早期診斷尋找新的標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 肺癌組 選取2015年9月-2016年7月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診并經(jīng)病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性肺癌的蘇北地區(qū)患者作為肺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡>18歲；（2）漢族；（3）無血緣關(guān)系；（4）經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)檢查確診為肺癌，包括小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌（如肺腺癌、肺鱗癌等）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有腫瘤史者；（2）曾接受過手術(shù)或放化療者；（3）伴有其他嚴(yán)重疾?。ㄈ缣悄虿?、無法控制的高血壓以及最近6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)過心力衰竭或心肌梗死等）者。

1.1.2 對(duì)照組 選取同期于該院進(jìn)行體檢的健康志愿者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）體檢結(jié)果報(bào)告為健康；（2）與肺癌組患者無血緣關(guān)系；（3）無腫瘤尤其是肺癌家族史；（4）無明確職業(yè)性致癌因素接觸史；（5）年齡、性別與肺癌組患者匹配。

本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過，所有受試者均知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 資料收集

收集兩組受試者的人口學(xué)資料，包括年齡、性別、個(gè)人疾病史、家族史、吸煙史等；采集肺癌組患者的病理學(xué)信息，包括病理類型、TNM分期、分化、轉(zhuǎn)移等。

1.3 XRCC1基因rs25487位點(diǎn)多態(tài)性分析

所有受試者均抽取外周靜脈血2 mL，采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司]提取DNA，操作方法參照說明書，產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱中保存。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法（Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）檢測受試者XRCC1基因rs25487位點(diǎn)的基因型。引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計(jì)并合成，上游引物：5′ -CCAACACCCCCAAGTACAGC-3′ ，下游引物：5′ -TGGAGGAGCAGTTTGTGCAA-3′ 。反應(yīng)體系：Dream Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各2 μL（1 μmol/L），DNA模板5 μL，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。酶切反應(yīng)體系：MspⅠ內(nèi)切酶1 μL（10 U/μL）、10×T Buffer 2 μL、0.1%牛血清蛋白2 μL、PCR產(chǎn)物10.0 μL，加去離子水至20 μL，于37 ℃下消化12 h。取酶切產(chǎn)物10 μg置于2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)果于1600R型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）上觀察，確定各基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析受試者基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。建立Logistic回歸模型評(píng)價(jià)XRCC1基因rs25487位點(diǎn)基因型與肺癌發(fā)生的相關(guān)性，以經(jīng)患者年齡、性別、吸煙史校正后的比值比（Odds ratio，OR）和95%置信區(qū)間（Confidence interval，CI）表示相對(duì)危險(xiǎn)度。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者一般資料比較

肺癌組共納入患者208例，其中男性129例，女性79例；平均年齡（60.51±8.32）歲；吸煙者116例，非吸煙者92例；腺癌96例，鱗癌86例，診斷不明確的26例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期75例，Ⅲ～Ⅳ期118例，分期不明確的15例。對(duì)照組共納入健康志愿者214例，其中男性132例，女性82例；平均年齡（60.01±8.85）歲；吸煙者84例，非吸煙者130例。兩組受試者的年齡及性別分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而肺癌組吸煙者的比例顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表1。

2.2 基因型分析

2.2.1 酶切結(jié)果 按“1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行試驗(yàn)，得XRCC1基因rs25487位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為408 bp。經(jīng)MspⅠ酶切后，AA型的酶切片段大小為408 bp，AG型的酶切片段大小為408、258、150 bp，GG型的酶切片段大小為258、150 bp，詳見圖1。

2.2.2 XRCC1基因型分布情況 共檢出XRCC1基因rs25487位點(diǎn)3種基因型：AA、AG、GG型。其中，對(duì)照組受試者AA、AG、GG型頻率分別為43.5%、41.1%、15.4%，肺癌組患者AA、AG、GG型頻率分別為28.8%、48.6%、22.6%。兩組受試者各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）；但其基因型分布組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 XRCC1基因rs25487位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌發(fā)生的相關(guān)性

Logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，與XRCC1基因AA型個(gè)體比較，AG型個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.265倍[OR=2.265，95%CI（1.299，3.950），P=0.040；經(jīng)校正的OR=2.309，95%CI（1.274，4.185），P=0.006]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GG型個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了1.310倍[OR=1.310，95%CI（0.771，2.228），P=0.318；經(jīng)校正的OR=1.429，95%CI（0.811，2.518），P=0.217]，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表3。

3 討論

DNA修復(fù)基因的SNP影響DNA的修復(fù)能力，是肺癌遺傳易感性的重要因素[3]。XRCC1基因定位于人類染色體19q13.2～13.3，包含17個(gè)外顯子，大小為33 kb。該基因編碼的XRCC1蛋白包含633個(gè)氨基酸，沒有已知的酶活性，但作為腳手架蛋白，可與DNA聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ一起參與DNA修復(fù)[5]。若個(gè)體XRCC1基因突變，可能會(huì)導(dǎo)致DNA修復(fù)功能的喪失[8-10]。目前，已發(fā)現(xiàn)與肺癌易感性相關(guān)的3個(gè)XRCC1基因SNP位點(diǎn)，分別為密碼子194（C26304T，第6外顯子，Arg194Trp）、密碼子280（G27466A，第9外顯子，Arg280His）和密碼子399（G28152A，第10外顯子，Arg399Gln，rs25487），且多集中在rs25487位點(diǎn)[8，10-11]。盡管國內(nèi)外有很多研究表明，XRCC1基因rs25487位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌易感性相關(guān)，但結(jié)果并不一致：Du Y等[8]的研究結(jié)果顯示，XRCC1基因rs25487位點(diǎn)堿基突變可增加個(gè)體罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)（P<0.05）；Natukula K等[11]報(bào)道，在印度人群中，攜帶XRCC1基因突變雜合型和突變純合型的個(gè)體罹患肺癌的概率顯著增加（P<0.05）；然而，Qian B等[12]在我國天津地區(qū)受試人群中并未發(fā)現(xiàn)XRCC1基因rs25487位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌易感性相關(guān)（P>0.05）。這提示，受試人群所在區(qū)域、環(huán)境及種族的差異均有可能對(duì)研究結(jié)果造成影響，故尋找本地區(qū)肺癌易感人群遺傳標(biāo)志物至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示，XRCC1基因rs25487位點(diǎn)突變雜合（AG）型是肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)基因型，攜帶該基因型的個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。上述結(jié)果提示，XRCC1基因突變與肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。XRCC1基因突變可導(dǎo)致基因序列的改變，從而影響其編碼蛋白的合成，在一定程度上抑制了BER過程，最終致使個(gè)體罹患肺癌的概率增加[13-14]。但本研究尚未發(fā)現(xiàn)GG（突變純合）型與肺癌易感性相關(guān)，這可能與XRCC1基因rs25487位點(diǎn)GG型在該地區(qū)人群中的分布偏少，且本研究樣本總量也偏小等因素有關(guān)，故此結(jié)論有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步予以驗(yàn)證。此外，研究過程中還發(fā)現(xiàn)，肺癌組吸煙者的比例顯著高于對(duì)照組，提示吸煙是誘發(fā)肺癌的重要危險(xiǎn)因素。

綜上，XRCC1基因rs25487位點(diǎn)突變雜合與我國蘇北地區(qū)漢族人群肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，此基因可作為肺癌預(yù)防和早期診斷的標(biāo)志物。此外，吸煙亦可增加個(gè)體罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，環(huán)境-基因交互作用對(duì)肺癌的影響不能忽視。但鑒于本研究樣本量偏小，本課題組將擴(kuò)大樣本量對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行證實(shí)，并進(jìn)一步在細(xì)胞水平揭示XRCC1基因突變對(duì)其編碼蛋白功能的影響及其機(jī)制。

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（收稿日期：2017-07-26 修回日期：2018-04-10）

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