七葉皂苷鈉通過CARMA3/NF-κB信號通路抑制肝癌細胞的增殖

李未祥，周大臣，王 石，崔 笑，侯 輝，耿小平

(安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽外科，安徽 合肥 230601)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]，對于HCC的治療，目前仍首選手術(shù)，但分子靶向治療逐漸成為熱點。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在細胞凋亡、病毒復制、腫瘤發(fā)生、炎癥和各種自身免疫疾病的調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要的作用，文獻報道其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中也起重要作用[2-4]。Caspase募集域和膜相關(guān)鳥苷酸激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白3(CARD recruited membrane associated protein 3，CARMA3)蛋白是NF-κB上游調(diào)節(jié)因子[5-7]。七葉皂苷鈉(sodium aescinate, SA)是一種天然植物提取物，于2006年2月被中國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)批準為臨床用藥，主要用于抗氧化、抗炎和保護血管損傷，相關(guān)研究證實七葉皂苷鈉能防止炎癥引起的肝損傷[8]。且NF-κB信號通路與氧化和炎癥相關(guān)[9]，所以我們假設，通過干擾CARMA3/NF-κB信號通路，七葉皂苷鈉可能有效抑制HCC的增殖。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1患者和標本 本研究已獲得安徽醫(yī)科大學第一及第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準。從我們的HCC組織庫中選取2000～2015年期間100例HCC患者的原發(fā)性肝癌腫瘤組織和相鄰肝組織。術(shù)前抗腫瘤治療或由CT、MRI或PET證實肝外轉(zhuǎn)移的患者被排除在本研究之外。所有患者均接受R0肝切除術(shù)。通過Edmondson分級系統(tǒng)表征分化和腫瘤分級。年齡、性別、肝硬化、腫瘤直徑、微血管浸潤、腫瘤分化情況等見Tab 1。每3個月進行1次隨訪，血清AFP、肝功能檢查、HBV-DNA和肝臟超聲檢查結(jié)果均記錄在案。隨訪的最后期限為2017年6月30日?？偵鏁r間是從首次手術(shù)到患者死亡日期或最后一次隨訪測量的。

1.1.2試劑 七葉皂苷鈉 (中國武漢化工生物化學股份有限公司,純度98%)；超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(pv9001,北京中杉金橋公司)；兔抗CARMA3多克隆抗體(ab36839，美國Abcam公司)；兔抗NF-κB(p65)單克隆抗體(D14E12，美國CST公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (美國Gibco公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(批號:556547, 美國BD公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司)。

1.1.3儀器 KHB(ST-360)酶標儀(中國上海)，CytoFLEX流式細胞儀(美國Beckman Coulter 公司)。

1.2方法

Tab 1 Correlation between CARMA3 expression and clinical characteristics of HCC patients

1.2.1組織微陣列免疫組化 手術(shù)切除的腫瘤標本用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。組織微陣列(TMA)由Ai-We-Er公司(中國武漢)制造。每個TMA 排列25對組織，切片4 μm厚，2 mm大小。使用超敏二步法進行免疫組化染色。將切片在二甲苯中脫石蠟，用梯度無水乙醇脫水，然后在0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中，在壓力鍋中煮沸3 min。用0.3%過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物活性，并將切片與正常山羊血清溶液在室溫下孵育1 h以減少非特異性結(jié)合。將一抗(CARMA3 1 ∶50稀釋，NF-κB 1 ∶200稀釋)在4℃孵育過夜。次日二抗在室溫下孵育1 h。

1.2.2細胞系和細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株HepG2、Hep3B和正常肝細胞系HL-02均獲自中國科學院細胞庫(www.cellbank.org.cn)。細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，每3 d更新培養(yǎng)基。

1.2.3MTT檢測 取對數(shù)生長期的細胞，以3×103個/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，以10、20、30、40 μmol·L-1的七葉皂苷鈉分別處理24、48、72 h。對照組與治療組給予相同量的溶劑(DMSO)。然后，向每個孔中加入10 μL MTT溶液(2.5 g·L-1)，將細胞在37℃下孵育4 h。加入150 μL DMSO，以溶解所得的晶體。使用酶標儀在570 nm處檢測OD值。使用以下公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率/%=(1-OD實驗組/ OD對照組)×100%。

1.2.4細胞凋亡檢測 使用Annexin V/PI法檢測細胞凋亡率。將細胞接種于6孔板，貼壁后用七葉皂苷鈉處理48 h，胰蛋白酶消化，預冷PBS洗滌2次后，用100 μL緩沖液(1×108·L-1)重懸后，轉(zhuǎn)移到5 mL培養(yǎng)管中，然后加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI，避光反應15 min，最后加入400 μL緩沖液至管中，通過流式細胞儀檢測。

1.2.5Western blot 將細胞在RIPA裂解液中冰浴裂解30 min，4℃、15 000 r·min-1離心20 min。將上清液保存在-80℃。使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)加載到10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5% BSA室溫下封閉1 h，抗體CARMA3(1 ∶100)和NF-κB(1 ∶1 000)在4℃孵育過夜。與二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h。ECL試劑盒顯色，Image J圖像處理系統(tǒng)分析Western blot灰度值。

1.2.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0版軟件進行分析，臨床基線資料和蛋白表達量相關(guān)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗及Fisher確切概率法。Kaplan-Meier檢驗用于生存數(shù)據(jù)分析，log-rank cox用于差異性檢驗。

2 結(jié)果

2.1CARMA3在人肝癌組織中過表達且與臨床病理、腫瘤直徑、TNM分期及預后相關(guān)患者基本特征見Tab 1。TMA免疫組織化學染色結(jié)果顯示(Fig 1)，CARMA3主要位于腫瘤細胞的細胞質(zhì)中，與57例(57%)HCC患者相比，相同患者的相鄰肝組織相對較高。 CARMA3在低分化和TNM惡性分期高的組織中的表達明顯高于相應的正常組織(P=0.004，P=0.008)。在腫瘤直徑大于5 cm的亞組中，腫瘤組織中CARMA3的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014)。然而，性別、年齡、HBV、AFP水平、Child-Pugh、肝硬化、腫瘤數(shù)目和微血管浸潤亞組CARMA3表達差異無統(tǒng)計學意義(Tab 1)。在100例患者中，93例患者完全隨訪記錄，分為高表達組和低表達組兩組。Kaplan-Meier曲線表明，CARMA3或NF-κB過表達患者總體生存期、總體存活率低于CARMA3或NF-κB低表達者(Fig 1B)。結(jié)果表明，CARMA3和NF-κB的過表達與總生存期明顯相關(guān)(P=0.027，P=0.005)，且CARMA3的表達程度明顯與NF-κB表達程度相關(guān)(P<0.01)。

2.2七葉皂苷鈉抑制HCC細胞增殖并誘導細胞凋亡七葉皂苷鈉處理72 h后能明顯抑制HepG2和Hep3B細胞株的增殖(IC50=46 μmol·L-1)。然而，七葉皂苷鈉對HL-02細胞系的增殖幾乎無影響。此外，七葉皂苷鈉的抑制作用呈時間和劑量依 賴性(Fig 2)。Fig 3流式實驗結(jié)果表明，七葉皂苷鈉能夠有效促進HepG2和Hep3B細胞系的凋亡。

Fig 1 Expression of CARMA3/NF-κB in hepatocellular carcinoma and adjacent paracancerous tissues and its correlation with prognosis

A:Expression of CARMA3 and NF-κB in HCC tissues was higher than that in paracancerous tissues; B:The patients with low CARMA3 and NF-κB expression had long overall survival time.

Fig 2 Effect of sodium aescinate on HCC cell lines and normal liver cell HL-02

A: Effect of sodium aescinate on three cell lines for 48 h; B: Effect on HepG2 of sodium aescinate was stronger with the concentration increase and time-dependent; C: Effect on Hep3B of sodium aescinate was stronger in a concentration- and time-dependent manner.**P<0.01vs24 h

Fig 3 Apoptosis of three cell lines at a concentration of 40μmol·L-1

A:The number of early apoptosis of SA-treated tumor cells was higher than that of the control group and not obvious in normal cells from the flow cytometry; B: The early apoptotic rate of SA-treated tumor cells was significantly higher than that of the control group, but no effect was detected on normal liver cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.3七葉皂苷鈉下調(diào)肝癌細胞株CARMA3和NF-κB的表達40 μmol·L-1七葉皂苷鈉處理肝癌細胞48 h后，F(xiàn)ig 4A免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，CARMA3的表達主要位于細胞質(zhì)中，而NF-κB主要在細胞核中表達，和免疫組化結(jié)果一致，且七葉皂苷鈉抑制HCC細胞中CARMA3和NF-κB的表達。Fig 4B Western blot結(jié)果進一步證實七葉皂苷鈉可下調(diào)CARMA3和NF-κB表達(P<0.05)。

3 討論

七葉皂苷鈉是一種天然植物提取物，因其在抗炎、抗氧化方面取得良好療效，被批準用于臨床，但其抗腫瘤作用研究報道較少。齊世美等[10]報道，七葉皂苷鈉能通過抑制Akt、ERK上游信號Src活性，誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡，但其在抗肝癌中的作用尚未見相關(guān)報道。CARMA3蛋白與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如腎癌、結(jié)腸癌、肺癌[11-14]，但在肝癌中的報道很少。在本研究中，我們使用TMA分析評估了HCC患者組織中CARMA3的表達及其臨床相關(guān)性。體外研究結(jié)果表明，七葉皂苷鈉通過抑制CARMA3/NF-κB信號通路，抑制肝癌細胞系的增殖并促進其凋亡，但對正常肝細胞無影響。

CARMA3在肝癌組織中的TMA染色結(jié)果顯示，在低分化的HCC組織或腫瘤直徑大于5 cm的腫瘤中CARMA3的表達較高，且表達程度與患者的總生存期呈正相關(guān)，CARMA3表達程度低的患者傾向更長的術(shù)后生存時間。本研究結(jié)果表明，CARMA3的表達程度與HCC組織中NF-κB的表達明顯相關(guān)，更進一步證明CARMA3是NF-κB的上游調(diào)節(jié)因子，揭示CARMA3/NF-κB信號通路在肝癌患者中處于激活狀態(tài)。體外研究發(fā)現(xiàn)，七葉皂苷鈉抑制HCC細胞株的增殖并誘導其早期凋亡，細胞免疫熒光和Western blot實驗證實，七葉皂苷鈉通過抑制CARMA3/NF-κB信號通路發(fā)揮其抗腫瘤作用。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，七葉皂苷鈉在相同濃度下，對正常 肝細胞幾乎沒有細胞毒性作用。眾所周知，HCC的化學療法不盡人意，且對于治療HCC的藥物總是在Ⅲ期試驗中失敗；雖然索拉非尼被批準為HCC的一線分子靶向藥物；然而索拉菲尼由于成本高，對患者有副作用，很難普及，且索拉非尼的耐藥性也是一個挑戰(zhàn)。因此，迫切需要找到一種有效和經(jīng)濟的藥物。本研究結(jié)果顯示，七葉皂苷鈉滿足這些條件，在治療HCC中具有潛在的臨床應用價值?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)CARMA3在肝癌組織中過表達，與HCC患者的預后相關(guān)，且七葉皂苷鈉通過抑制CARMA3/NF-κB信號通路，能有效抑制人肝癌細胞的增殖。

A: Immunofluorescence was used to detect the expression of CARMA3 and NF-κB in cells; B: Western blot was used to detect the expression of CARMA3 and NF-κB; C: CARMA3 and NF-κB gray value ratio.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.