孟 丹， 孟慶玲， 喬 軍， 蔡擴(kuò)軍， 于偉偉， 伍曄暉， 才學(xué)鵬， 陳創(chuàng)夫

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

金黃色葡萄球菌是一種感染人畜最為常見(jiàn)的病原菌[1]。目前，人類醫(yī)源感染的病原菌多為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methcillin resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，會(huì)引起深部感染以及皮膚感染，具有較高的發(fā)病率和病死率[2]。動(dòng)物源特別是牛源MRSA感染易引起奶牛嚴(yán)重的乳房炎和子宮內(nèi)膜炎，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心報(bào)告，在細(xì)菌感染引起的疾病中，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第2位，僅次于大腸桿菌[3]。此外，一些致病性金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生多種致病因子，如lukF、lukS、hla、hlb等，這些致病因子可誘發(fā)炎癥，并引起組織損傷，加劇了臨床治療難度[4]。

金黃色葡萄球菌能夠分泌多種毒素和酶，這些毒力蛋白的表達(dá)由RNA Ⅲ調(diào)控，它是Agr(accessory gene regulator)位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的一個(gè)中心多向調(diào)節(jié)因子。目前，認(rèn)為RNAⅢ至少是由2個(gè)雙組分系統(tǒng)激活，這2個(gè)雙組分系統(tǒng)一個(gè)是由agr位點(diǎn)編碼的AgrC與AgrA，在金黃色葡萄球菌中，研究最清楚的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)是AgrCA[5]。金黃色葡萄球菌的大多數(shù)毒力因子是由Agr位點(diǎn)調(diào)控，基于Agr編碼的自動(dòng)誘導(dǎo)肽和相關(guān)受體的氨基酸序列多態(tài)性，學(xué)者們把金黃色葡萄球菌Agr分成4個(gè)主要基因型(Ⅰ～Ⅳ)[6]。為此，本研究利用多重PCR技術(shù)，分析了新疆地區(qū)MRSA不同流行株的Agr基因型的流行狀況，并檢測(cè)了MRSA流行株的部分毒力基因攜帶狀況，以期了解MRSA新疆流行株的分子特征，為進(jìn)一步研究毒力基因與Agr不同基因型之間的內(nèi)在聯(lián)系，以提供流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌(E.coli)DH5α菌種，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、pMD19-T載體，DNA Marker，均購(gòu)自TaKaRa公司；生化鑒定管，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自諾維森(北京)生物科技有限公司。

1.2 樣品的采集

分別從新疆五家渠、石河子、沙灣、烏魯木齊4個(gè)地區(qū)的規(guī)?；膛?chǎng)，采集臨床型乳房炎和子宮內(nèi)膜炎樣品221份，乳樣采集通過(guò)溫水清洗乳房并使用75%乙醇棉球?qū)θ轭^進(jìn)行消毒處理，收集第3把奶后的奶樣。子宮內(nèi)膜炎樣品通過(guò)直腸把握子宮直接采樣法收集，放于滅菌的試劑管中，置于冰盒中，運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3 引物

根據(jù)GenBank中已公布的金黃色葡萄球菌的耐藥基因mecA序列和部分毒力基因序列，應(yīng)用primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，再送至北京華大生物科技有限公司合成備用。本研究中所用的主要耐藥基因和部分毒力基因的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 耐藥基因和部分毒力基因的引物

1.4 分離鑒定

將采集的樣品接種于甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基，放置于 37 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)12～48 h。挑取具有典型特征的單菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，對(duì)純化菌進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。隨機(jī)選取分離株用SA生化鑒定管測(cè)定其生化反應(yīng)特性，根據(jù)GenBank中已公布的金黃色葡萄球菌16S rRNA的序列設(shè)計(jì)通用引物，對(duì)SA分離株進(jìn)行16S rRNA序列比對(duì)分析，鑒定分離株為金黃色葡萄球菌。將分離的金黃色葡萄球菌在BHI肉湯中37 ℃培養(yǎng)24 h，再將500 μL所得新鮮菌液加入到500 μL 40%甘油中振蕩混合均勻制成20%甘油菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 藥敏試驗(yàn)及MRSA確證方法

用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，接種于BHI培養(yǎng)液于 37 ℃ 培養(yǎng)20～24 h，再用滅菌生理鹽水將細(xì)菌濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，?00 μL均勻涂布于MHA培養(yǎng)基，涂布均勻后貼上苯唑西林藥敏紙片，用鑷子輕壓紙片使其與培養(yǎng)基表面緊密接觸。放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后測(cè)量抑菌圈直徑。進(jìn)一步通過(guò)PCR方法擴(kuò)增mecA來(lái)確定MRSA陽(yáng)性菌。判斷30 μg苯唑西林抑菌環(huán)直徑≤1 cm的菌株，即為MRSA。

1.6 毒力基因的檢測(cè)

采用多重PCR的方法[7]對(duì)毒力基因白細(xì)胞毒素基因(PVL、lukED、lukM)、溶血素基因(hla、hlb、hld)、表皮剝脫素基因(eta、etb)、中毒休克綜合征毒素基因tst和黏附素基因edin進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 菌株基因組DNA提取

用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落接種至無(wú)菌BHI培養(yǎng)液于37 ℃振蕩過(guò)夜，取1.5 mL細(xì)菌培養(yǎng)液于無(wú)菌EP管內(nèi)在 12 000 r/min 下高速離心，棄去上清后，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。DNA提取結(jié)束后，采用4 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)上照相。DNA模板于-20 ℃保存，用于Agr分型研究。

1.8 Agr基因分型

根據(jù)Agr等位基因(Ⅰ～Ⅳ)4種類型，引物合成參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。采用多重PCR擴(kuò)增4種類型的基因，PCR擴(kuò)增條件如下：95 ℃，5 min；95 ℃，40 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增后，取其產(chǎn)物10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電脈(1.5%)，80 V40 min，凝膠成像系統(tǒng)照相，觀察擴(kuò)增條帶，比較電泳圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRSA的分離與鑒定

從新疆4個(gè)不同的牛場(chǎng)采集了221份樣，共分離到71株金黃色葡萄球菌，在甘露醇高鹽培養(yǎng)基中長(zhǎng)出黃色或乳白色菌落(圖1)。其中MRSA有13株，4株來(lái)自沙灣，4株來(lái)自烏魯木齊，2株來(lái)自石河子，3株來(lái)自五家渠(表2)。并且13株菌的mecA基因檢測(cè)均為陽(yáng)性。MRSA流行株占5.9%(13/221)。

表2 13株MRSA毒力基因的檢測(cè)結(jié)果

2.2 MRSA毒力基因的檢測(cè)

13株MRSA經(jīng)PCR擴(kuò)增10對(duì)毒力基因，出現(xiàn)3種毒力基因特征性條帶(圖2)。其中，2株同時(shí)檢出毒力基因hld、lukED、tst，1株同時(shí)檢出毒力基因hld、tst，2株僅檢出毒力基因TST，其他菌株均檢出毒力基因lukED、TST，可見(jiàn)除3株菌檢出溶血素毒力基因hld外，白細(xì)胞毒素基因lukED和中毒休克綜合征毒素基因tst為主要檢測(cè)出的毒力基因(表2)。

2.3 Agr基因分型結(jié)果

由圖3、表3、圖4可知，13株MRSA流行株Agr分型出現(xiàn)2種特征性條帶，均為AgrⅠ型和AgrⅣ型，且每株菌同時(shí)具有2種分型，其中AgrⅡ型和AgrⅢ型均未檢出，Agr分型與毒力基因的分布存在一定的差異。

3 討論

目前，MRSA仍然是全世界感染的最嚴(yán)重的病原菌之一，并且呈不斷增加的趨勢(shì)[9]。與甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌相比， MRSA具有更強(qiáng)的引發(fā)患畜感染及發(fā)生菌血癥的能力[10]，而這與MRSA攜帶的獨(dú)特的毒力因子密切相關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，MRSA的主要毒力因子有腸毒素、殺白細(xì)胞毒素、溶血素、毒性休克綜合征毒素等，這些毒力因子因具有不同的生物學(xué)特性而呈現(xiàn)出不同的致病特征[11]。在本研究中，從13株MRSA中共檢出hld、ukED、tst這3種毒力基因，其中l(wèi)ukED和tst檢出率相對(duì)較高， 且出現(xiàn)同一株菌攜帶3種或2種毒力基因的情況，表明MRSA的毒力差異不僅體現(xiàn)在菌株之間，還與細(xì)菌本身的進(jìn)化以及宿主因素的影響關(guān)系密切。而對(duì)于檢出的hld是1種溶血素，可在宿主細(xì)胞膜上形成小孔，造成細(xì)胞內(nèi)液外流而導(dǎo)致細(xì)胞破壞[12]。lukED屬于一種白細(xì)胞毒素，是MRSA的重要毒力基因，可以對(duì)抗宿主的免疫系統(tǒng)[13]。tst主要與編碼基因的一些特定可移動(dòng)序列有關(guān)，可表達(dá)tst-1，是一種超抗原，能夠直接活化T淋巴細(xì)胞，使其在感染患者體內(nèi)釋放出炎癥介質(zhì)而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病[14]。MRSA及其攜帶的hld、lukED、tst毒力基因的流行，使其成為牲畜感染的主要致病菌，給患畜的抗感染臨床治療帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，檢測(cè)MRSA的毒力基因可為臨床治療及感染控制提供依據(jù)。

表3 13株MRSA流行株Agr分型

金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)Agr是最早發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌調(diào)控位點(diǎn)[15]。同時(shí)，也被認(rèn)為是金黃色葡萄球菌最重要的群集感應(yīng)系統(tǒng)，它影響著許多外毒素和胞外蛋白的分泌表達(dá)[16]。金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)子(Agr)位點(diǎn)是一個(gè)全面的群集感應(yīng)系統(tǒng)并且控制著毒力因子的產(chǎn)生。盡管Agr基因在細(xì)菌的毒力調(diào)節(jié)上具有重要的影響，研究表明大量的抗生素使用會(huì)造成金黃色葡萄球菌出現(xiàn)Agr陰性，抗生素產(chǎn)生的耐藥也會(huì)使毒力出現(xiàn)一定程度的下降[17-18]?？梢?jiàn)Agr基因與抗生素、毒力因子之間可能存在一定的聯(lián)系。王瓊等針對(duì)人源、牦牛源、食品源、雞源和羊源金黃色葡萄球菌分離菌株進(jìn)行Agr基因分型檢測(cè)出AgrⅡ、AgrⅢ、AgrⅣ 3種型[19]。Xie等的研究表明，108株醫(yī)院源菌株分離菌株中，AgrⅠ型占據(jù)最流行地位[20]。在本研究中，從新疆牛源MRSA菌株中檢出Agr Ⅰ和Agr Ⅳ型，Agr Ⅳ與王瓊等從不同來(lái)源的樣品中檢出的Agr型相同，Agr Ⅰ與Xie等從醫(yī)院源菌株檢出的Agr型[20]相同，可見(jiàn)MRSA有可能在Agr基因水平上有人畜間傳播的可能。本研究為MRSA分離株的分子分型奠定一定基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步探討MRSA毒力因子與Agr之間的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

近年來(lái)，隨著新疆地區(qū)奶牛飼養(yǎng)方式的改變，奶牛規(guī)?；B(yǎng)殖迅速發(fā)展，乳房炎和子宮內(nèi)膜炎已經(jīng)成為奶牛的高發(fā)病和常發(fā)病，成為制約新疆奶牛業(yè)發(fā)展的瓶頸。為了防治奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎，在獸醫(yī)臨床上大量使用抗菌藥物，導(dǎo)致MRSA菌株不斷出現(xiàn)，給該病的防控和人們健康帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在奶牛上檢出MRSA菌株日益增多，而且隨著MRSA菌株的不斷遺傳進(jìn)化，耐藥表型、傳播規(guī)律和致病機(jī)理越來(lái)越復(fù)雜，提示牛源的MRSA與人源MRSA之間的關(guān)系越來(lái)越密切，MRSA在人畜之間，甚至不分國(guó)界的傳播與擴(kuò)散也越來(lái)越嚴(yán)重。因此，開(kāi)展牛源MRSA分子流行病學(xué)和毒力基因檢測(cè)研究，對(duì)于防控型人-畜之間MRSA的相互傳播至關(guān)重要。