王 健，王 玲，魯康樂，宋 凱，張春曉

(廈門市飼料檢測與安全評價重點實驗室，集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

腸道是動物機體與外界環(huán)境接觸最為密切的器官之一，也是最大的免疫器官，在腸道中共生著大量微生物。大部分腸道微生物與動物構(gòu)成共生關(guān)系，相互依賴，在動物的生長、營養(yǎng)、免疫等方面均發(fā)揮著重要的作用[1-2]。研究表明，仔豬小腸中的微生物能大量代謝必需氨基酸，參與氨基酸的腸道首過代謝，并且對氨基酸表現(xiàn)出較強的合成能力[3]；牛的瘤胃中的微生物可以幫助其消化植物纖維，攝取所需能量，還具有分解有毒物質(zhì)的能力[4-5]；大菱鲆(Scophthalmusmaximus)腸道中微生物與碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸代謝功能相關(guān)[6]。因此，研究動物生理，尤其是營養(yǎng)代謝，必須考慮腸道微生物作用。

在過去對腸道微生物組成的研究中，傳統(tǒng)方法如DGGE、TGGE、T-RFLP、FISH等，往往會很大程度地低估腸道微生物的物種組成并高估其豐度[7]。高通量測序技術(shù)具有較高準(zhǔn)確性和靈敏度的優(yōu)勢，不需要進行腸道微生物的分離和培養(yǎng)，只要提取到腸道微生物DNA后，就能得到相應(yīng)菌種信息，能夠較為完整地反映腸道微生物結(jié)構(gòu)。王程程等[8-9]的研究表明，高通量測序技術(shù)相比傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢，鑒定所得腸道微生物組成信息更為完整。目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)在黃顙魚(Pseudobagrusfulvidraco)[10]、大菱鲆[11]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[12-13]等多種水生動物腸道微生物研究中運用，是目前對動物腸道微生物研究中應(yīng)用最廣泛的方法之一。

牛蛙(Rana(Lithobates)catesbeiana)是我國福建、廣東、浙江和海南等地重要的養(yǎng)殖種類之一，2013年國內(nèi)牛蛙養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)15萬t以上[14]。研究表明，大多數(shù)動物缺乏內(nèi)源性纖維素消化酶基因，纖維素的消化主要依靠腸道內(nèi)與纖維素降解相關(guān)的菌群[15-16]，因此腸道微生物組成很大程度上決定了動物利用植物原料能力的高低。已有研究發(fā)現(xiàn)牛蛙對豆粕耐受能力較強[17]，并且對植物性蛋白原料有較高的表觀消化率[18]。根據(jù)以往研究結(jié)果推測，攝食植物性蛋白原料的牛蛙腸道中應(yīng)存在較高比例與植物性原料消化相關(guān)的菌群，然而，目前尚未有對牛蛙腸道微生物組成的相關(guān)報道。本文將運用高通量測序技術(shù)，研究攝食全豆粕蛋白飼料的牛蛙腸粘膜及腸腔內(nèi)容物的微生物組成，擬從腸道微生物組成來解釋牛蛙對豆粕有較高利用率的原因，并為深入研究牛蛙營養(yǎng)代謝機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗用飼料以豆粕為主要蛋白源，魚油、豆油和卵磷脂為主要脂肪源，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%。飼料原料粉碎后全部通過60目篩網(wǎng)，用水產(chǎn)飼料膨化機制成4.0 mm的膨化顆粒飼料，自然晾干后于-20 ℃冰箱中保存。試驗飼料配方和化學(xué)組成見表1。

1.2 試驗牛蛙的養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖蛙苗為廈門市同安區(qū)一養(yǎng)殖場提供的同批次孵化蛙苗。正式試驗開始前，牛蛙暫養(yǎng)于室內(nèi)水族缸(1.5 m×0.7 m×0.6 m)中，投喂商業(yè)牛蛙飼料(由福建省海新集團有限公司提供)。暫養(yǎng)15 d 后，停食24 h，挑選個體大小均勻，體表無損傷的健康牛蛙隨機分配到室內(nèi)6個水族缸(0.7 m×0.4 m×0.4 m)中，除排列位置外，各缸管理、光照、用水均保持一致。試驗牛蛙初始體重為(40.01±0.24)g，每個養(yǎng)殖缸放養(yǎng)14只牛蛙，每天投喂2次(8：00，18：00)，達(dá)表觀飽食狀態(tài)。養(yǎng)殖試驗持續(xù)56 d。試驗期間水溫30～32 ℃，投喂前半小時對各缸進行清洗和換水，水位為3～5 cm。

表1 試驗飼料配方及營養(yǎng)組成(干物質(zhì))

說明： 1)參考文獻[19]；2)，3)參考文獻[18]。

Notes:refer to referenc [19]；2)，3) refer to reference[18].

1.3 腸道樣品采集

56 d試驗結(jié)束時停食24 h后，選擇健康狀況良好、大小相似的牛蛙(平均體重為(133.56±0.14)g)，每缸6只，用雙毀髓法處死，剪下牛蛙腸道并用鑷子按壓收集牛蛙腸腔內(nèi)容物置于滅菌凍存管中；收集完成后剪開腸段，用無菌生理鹽水沖洗腸粘膜，取另一凍存管存放腸粘膜樣品；每2個養(yǎng)殖缸樣品混合視為同一樣品。樣品采集完成后迅速放入液氮中保存，用于微生物多樣性分析。

1.4 細(xì)菌V3+V4區(qū)微生物多樣性測序

提取樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化后形成測序文庫，對建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行微生物多樣性測序。

1.5 計算和統(tǒng)計方法

使用QIIME(Version 1.8.0)軟件中的UCLUST對Tag在97%的相似度水平下進行OTU(operational taxonomic units)聚類分析；利用QIIME軟件生成不同分類水平下的物種豐度表；使用Mothur(Version 1.30)軟件，對樣品Alpha多樣性指數(shù)(Chao1、Ace、Shannon、Simpson)進行評估；使用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，實驗結(jié)果采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示；基于unweighted unifrac算法得到樣本間距矩陣用于主成分分析(PCA)；基于non-parametric factorial Kruskal-Wallis(KW) sum-rank test(非參數(shù)因子克魯斯卡爾—沃利斯秩和驗檢)檢測具有顯著豐度差異特征，用線性判別分析(LDA)來估算差異大小。本文所有圖均根據(jù)數(shù)據(jù)用R語言工具繪制。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)過濾、拼接及稀釋曲線

對牛蛙腸腔內(nèi)容物樣品(DN)和腸粘膜樣品(DC)中細(xì)菌的16S rDNA基因的V3-V4區(qū)測序，所有樣品經(jīng)過雙端reads(PE read)拼接后得到517 972條原始序列(Raw Tags)，經(jīng)過原始序列過濾后得到的優(yōu)化序列(Clean read)共有487 821條，平均每個樣品產(chǎn)生81 303條序列，最多的產(chǎn)生108 448條，最少的65 443條，樣品平均序列長度(AvgLen)為436.17 bp，優(yōu)化序列數(shù)平均占原始雙端reads總數(shù)的63.035%，表明本次提取樣品的DNA質(zhì)量良好。

稀釋性曲線(見圖1)顯示，當(dāng)抽取序列數(shù)達(dá)到50 000條時，每組樣品的稀釋曲線都趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新OTU的貢獻很小，表明此次測序樣本抽取序列充分，結(jié)果可靠。

2.2 牛蛙腸粘膜及腸腔內(nèi)容物微生物OTU劃分及Alpha多樣性比較

表2為將樣品序列按最小序列數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化后，在97%相似度水平下，比較Alpha多樣性指數(shù)。結(jié)果顯示，在0.99的樣本文庫覆蓋率下，樣品間 OTU數(shù)量、豐度指數(shù)Ace及Chao1，DN組均大于DC組，但未具顯著性(P>0.05)；多樣性Shannon指數(shù)差異不顯著(P>0.05)； Simpson指數(shù)DN組顯著低于DC組(P<0.05)。

表2 不同樣品微生物群落的豐度和多樣性指數(shù)

說明：同一列數(shù)據(jù)的肩標(biāo)不同字母，則表示顯著性差異(P<0.05)。

Note：In the same column values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05) .

2.3 門、屬分類水平上牛蛙腸粘膜及腸腔內(nèi)容物微生物組成

物種分布柱狀圖顯示，在門分類水平(見圖2)上， DC組中梭桿菌門(Fusobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)為牛蛙腸粘膜的優(yōu)勢菌，分別占總菌群數(shù)量的78%和20%，厚壁菌門(Firmicutes)約占1%； DN組中，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和梭桿菌門(Fusobacteria)為牛蛙腸道內(nèi)容物中的優(yōu)勢菌，分別占總菌群的76%、15%和5%，放線菌門(Actinobacteria)約占1%。在屬分類水平(見圖3)上，DC組中菌群組成表現(xiàn)出高度相似性，其中梭桿菌門(Fusobacteria)的鯨桿菌屬(Cetobacterium)、變形菌門(Proteobacteria)的埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)和愛德華氏菌屬(Edwardsiella)為主要優(yōu)勢菌群，分別占總菌群比例的75%、3%和2%左右；DN組菌群組成在屬分類水平上未顯示出明顯規(guī)律。

2.4 牛蛙腸粘膜及腸腔內(nèi)容物微生物樣品PCA分析

樣品微生物PCA分析(見圖4)顯示，PC1成分貢獻率為70.57%，PC2成分貢獻率為19.00%，2種成分的累計貢獻率已達(dá)89.57%，能反映樣本的大部分信息，表明通過PCA分析可以較好區(qū)分樣品。其中腸粘膜樣品DC主要分布在二、三象限交界處，且3組樣品相對聚集；腸道內(nèi)容物DN的3組樣品分散在一、四象限中，且彼此間間距較大。表明經(jīng)過56 d飼養(yǎng)后，牛蛙腸粘膜上微生物組成基本穩(wěn)定，且與腸腔內(nèi)容物微生物組成存在明顯差異。

2.5 組間樣品LDA值分布

組間樣品的LDA值分布見圖5。進化分支圖由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別，在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比，而著色原則為將無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，其他差異物種按該物種所在豐度最高的分組進行著色。結(jié)果顯示，DC組與DN組微生物相對豐度存在顯著差異(LDA值>4)的菌群，分屬于三個門類，分別為變形菌門的γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)和α變形菌綱(Alphaproteobacteria)，梭桿菌門的梭桿菌綱(Fusobacteriia)和厚壁菌門(Firmicutes)的芽孢桿菌綱(Bacilli)。其中，在屬水平上，DC組中鯨桿菌屬(Cetobacterium)、埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)和愛德華氏菌屬(Edwardsiella)相對豐度高于DN組；DN組中的不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomnas)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)相對豐度高于DC組。

3 討論

動物腸道微生物是一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。隨著對腸道微生物功能研究的逐漸深入，許多研究表明腸道微生物能夠參與并影響宿主營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)節(jié)[3，5，20]，因此在動物生理研究，尤其是營養(yǎng)代謝的研究中，必須充分考慮腸道微生物的作用。以往的研究結(jié)果表明，水生動物的飼料組分是影響其腸道微生物組成的重要因素之一[21]，如攝食豆粕飼料的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)，其腸道中存在高比例的厚壁菌和變形菌[22]；攝食豆粕飼料的草魚(Ctenopharyngodonidellus)和鯽魚(Carassiusauratus)，腸道中存在高比例的厚壁菌和變形菌，并且鯽魚腸道還存在高比例的梭桿菌[23]；攝食豆粕飼料的金頭鯛(Sparusaurata)，其腸道存在高比例的厚壁菌、放線菌[24]。本次試驗結(jié)果顯示，攝食全豆粕蛋白的牛蛙，其腸道主要優(yōu)勢菌群為梭桿菌、變形菌以及厚壁菌，這與以往對攝食豆粕蛋白的魚類腸道微生物研究結(jié)果是一致的，并且與王純等[25]對草食性的草魚及團頭魴(Megalobramaamblycephala)腸道微生物研究結(jié)果相似，均以變形菌門及厚壁菌門細(xì)菌為腸道優(yōu)勢菌種，相似的結(jié)果也在趙晗旭[26]對陸地草食性動物的研究中有報道，暗示此門類細(xì)菌在腸道中的優(yōu)勢存在可能與攝食植物性蛋白源有關(guān)。

以往的研究[23]表明，水產(chǎn)動物腸腔內(nèi)容物與腸粘膜中的微生物組成存在一定的相似性，并且都受外源環(huán)境(水、飼料等)微生物的影響，但同時宿主本身對腸粘膜定植菌種有一定的選擇作用[23]。本次試驗中，微生物組成結(jié)構(gòu)圖顯示，牛蛙腸腔內(nèi)容物中優(yōu)勢菌種門類為變形菌門(76%)、厚壁菌門(15%)和梭桿菌門(5%)；牛蛙腸粘膜樣品中優(yōu)勢菌種門類為梭桿菌門(78%)和變形菌門(20%)；LDA值分布顯示，牛蛙腸腔內(nèi)容物中變形菌門的菌豐度顯著高于腸粘膜組，表明攝食全豆粕蛋白飼料的牛蛙腸腔內(nèi)容物中優(yōu)勢菌為變形菌，且多數(shù)不能在牛蛙腸粘膜上定植。王程程等[9]研究表明變形菌門類細(xì)菌是飼料和養(yǎng)殖水體中最優(yōu)勢菌種，而牛蛙腸腔內(nèi)容物主要由未被完全消化的食物殘渣組成，牛蛙的進食行為會將飼料及水體中攜帶的微生物帶入到腸腔中，這可能是在牛蛙腸腔內(nèi)容物中檢測出大量變形菌的主要原因，而攝食等行為帶來的外源微生物只有小部分能在腸粘膜上定植[27]，導(dǎo)致腸腔內(nèi)容物中最優(yōu)勢存在的變形菌在腸粘膜上不顯最優(yōu)勢性，這與以往的研究結(jié)果是一致的。

本次試驗結(jié)果顯示：牛蛙腸粘膜上最優(yōu)勢菌門為梭桿菌門，且其豐度顯著高于腸腔內(nèi)容物中的該菌，表明該門類菌受外源環(huán)境影響較小，可以在腸粘膜上定植；在屬分類水平，梭桿菌門下鯨桿菌屬是最優(yōu)勢菌種。以往研究表明，在人類、大熊貓、牛以及硬骨魚[15-16]體內(nèi)缺乏內(nèi)源性纖維素消化酶基因，因此其對纖維素的消化主要依靠腸道內(nèi)與纖維素降解相關(guān)的菌群；Parma等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金頭鯛飼料中植物纖維成分增加時，其腸道中具消化纖維素能力的菌群會增多；Wu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，草魚腸道中優(yōu)勢菌群為梭桿菌門細(xì)菌，其具有降解植物纖維、促進碳水化合物的發(fā)酵和能量轉(zhuǎn)換的功能，可提高植物成分消化率；文獻[16，29]研究表明，梭桿菌門下鯨桿菌屬細(xì)菌在淡水草食性、雜食性和濾食性魚類腸道中為常見優(yōu)勢菌，具有發(fā)酵多肽、碳水化合物的能力，還可以產(chǎn)生維生素B12，被認(rèn)為是一種具益生作用的菌種。本次試驗結(jié)果還顯示，當(dāng)牛蛙攝食富含植物纖維成分的豆粕飼料時，其腸粘膜上會定植大量梭桿菌門及其門下鯨桿菌屬細(xì)菌，這些菌種與碳水化合物及纖維素消化相關(guān)，可以幫助宿主消化并利用植物性蛋白，這可能是Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)牛蛙對飼料中植物性原料有較高利用率的原因之一。

PCA分析結(jié)果顯示，經(jīng)過56 d養(yǎng)殖試驗后，腸粘膜樣品間的微生物組成相似度較高，而腸道內(nèi)容物樣品的微生物組成相似度較低。這表明：當(dāng)牛蛙適應(yīng)養(yǎng)殖條件和環(huán)境時，其腸腔內(nèi)容物微生物組成容易受到外源微生物影響，個體間差異也較大，而腸粘膜微生物菌群結(jié)構(gòu)達(dá)到動態(tài)平衡后更為穩(wěn)定，受個體差異影響較小，更適合用于研究飼料對牛蛙腸道微生物組成的影響。

埃希氏菌-志賀氏菌屬和愛德華氏菌屬是水產(chǎn)動物常見致病菌，能夠?qū)е滤a(chǎn)動物腹瀉、腹水及敗血癥等疾病[30-32]。以往研究認(rèn)為，豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子能夠破壞腸道組織結(jié)構(gòu)，影響營養(yǎng)成分吸收利用，是引起水產(chǎn)動物腸道炎癥的主要原因之一[33-34]。本實驗結(jié)果顯示，飼喂牛蛙全豆粕蛋白飼料，其腸道粘膜上會定植一定比例的埃希氏菌-志賀氏菌屬和愛德華氏菌屬細(xì)菌，這兩類菌均為條件致病菌，在特定條件下，會引發(fā)宿主腸道疾病，這或許是植物蛋白替代魚粉后，動物腸道炎癥發(fā)生的原因之一。

本次實驗中，牛蛙腸道內(nèi)容物的微生物豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)均大于腸粘膜，但不顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，其原因可能是本次試驗中將多個采集樣品混作一個樣品進行檢測，造成最終統(tǒng)計樣本不足，因此統(tǒng)計學(xué)差異不顯著，應(yīng)在今后研究中避免此類問題。本次試驗顯示，攝食全豆粕蛋白飼料的牛蛙腸粘膜上會定植與碳水化合物及纖維素消化相關(guān)的梭桿菌門和鯨桿菌屬細(xì)菌，后續(xù)將對牛蛙飼料中豆粕的添加比例對腸粘膜上該門類細(xì)菌數(shù)量的影響進行研究，從而進一步揭示腸道微生物對牛蛙營養(yǎng)代謝的影響。

4 結(jié)論

本次試驗結(jié)果表明攝食全豆粕蛋白飼料的牛蛙腸粘膜上會定植大量與碳水化合物及纖維素消化相關(guān)的梭桿菌門及其門下鯨桿菌屬細(xì)菌，這可能是牛蛙對植物性原料有較高利用率的原因，但同時高水平豆粕也存在引起牛蛙腸道疾病的潛在風(fēng)險。