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      不同濃度DAPT對(duì)體外培養(yǎng)的糖尿病大鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖影響的研究

      2018-09-12 10:42:00范東旭劉彥東薛金枝王瀚銳程明勛金松

      范東旭 劉彥東 薛金枝 王瀚銳 程明勛 金松

      【摘要】目的 探討不同濃度DAPT對(duì)體外培養(yǎng)的糖尿病大鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響,探尋適宜濃度,為研究糖尿病血管再生奠定基礎(chǔ)。方法 取已完成鑒定凍存的糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞,進(jìn)行復(fù)蘇與傳代,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。對(duì)照組不加抑制劑,實(shí)驗(yàn)組不同濃度的DAPT(0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00μmol/L),觀察0、12、24、48、72 h后進(jìn)行MTT監(jiān)測(cè)。結(jié)果 DAPT對(duì)DM大鼠VSMCs有抑制作用,這種抑制作用在0.15~7.50 μmol/L濃度之間呈時(shí)間-濃度依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),7.50 μmol/L濃度以上無明顯變化,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);根據(jù)作用曲線,各時(shí)間段DAPT對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率大約出現(xiàn)在0.15 ?mol/L和2.50?mol/L,且72小時(shí)時(shí)對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率較其余各時(shí)間段明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 DAPT對(duì)DM大鼠VSMCs有抑制作用,一定濃度之間呈時(shí)間-濃度依賴性,濃度過低或過高均無抑制作用,為糖尿病血管再生提供了新位點(diǎn)。

      【關(guān)鍵詞】血管平滑肌細(xì)胞;體外原代培養(yǎng);γ-分泌酶抑制劑(DAPT);MTT

      【中圖分類號(hào)】R363 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2018.06.16..02

      隨著糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐漸增加,引起血管外科醫(yī)生高度重視,對(duì)糖尿病患者血管再生的研究成為熱點(diǎn),相關(guān)研究證明,Notch信號(hào)通路能促進(jìn)非糖尿病動(dòng)物缺血區(qū)的血管新生、動(dòng)靜脈分化等,本課題應(yīng)用不同濃度的γ-分泌酶抑制劑(DAPT)對(duì)Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵酶γ-分泌酶進(jìn)行抑制,探尋適宜血管再生的濃度,為進(jìn)一步研究DM下肢缺血區(qū)血管新生提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

      1 材料與試劑

      1.1 組織來源

      已完成鑒定凍存的糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞。

      1.2 試劑

      0.25%胰酶細(xì)胞消化液 invitrogen 公司,TRYPSIN 0.25%EDTA(25200056 Life),D-PBS (sh30028.01B Hyclone),D-Hanks液(不含Ca、Mg)(sh30030.03B Hyclone),γ-分泌酶抑制劑(DAPT)(美國(guó)Sigma公司),細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(MTT BB-4201貝博生物)。

      1.3 培養(yǎng)基

      在DMEM培養(yǎng)液(Gibco BRL,USA)培養(yǎng)基中添加15%胎牛血清(南美)(sv30087.02 Hyclone)、1%青霉素、1%鏈霉素,200目篩,一次性過濾除菌器除菌備用(4周內(nèi)用完)。

      1.4 器械及儀器

      T25培養(yǎng)瓶,倒置顯微鏡,細(xì)胞計(jì)數(shù)板、超凈工作臺(tái),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板Corning Inc等。

      2 方 法

      2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及傳代[1-2]

      從液氮罐中取冷凍管,迅速放入38℃水浴中,并不時(shí)搖動(dòng),使其1 min內(nèi)完全融化,然后在超凈工作臺(tái)中打開凍存管,用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中,滴加10ml 培養(yǎng)液;然后1000 r/min離心5 min,棄上清,加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中,接種濃度1*10g/L,置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日更換養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),觀察生長(zhǎng)情況,若細(xì)胞在80%~90%融合時(shí)即可細(xì)胞傳代,以后根據(jù)情況在長(zhǎng)滿1~2天后開始傳代;所有操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行,將細(xì)胞懸液按1:2傳代培養(yǎng),加入培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后,置37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3 d換培養(yǎng)液一次,傳代至第3代時(shí)可進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。

      2.2 MTT實(shí)驗(yàn)[3]

      用0.25%胰蛋白酶消化并收集DM大鼠VSMCs,計(jì)數(shù)細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液。以2.0×104/ml、200 μl/孔接種于96孔板上,加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。將γ-分泌酶抑制劑DAPT儲(chǔ)存溶液倍比稀釋為工作液終濃度分別為0.15、0.30、0.45、0.6、0.75、1.25、2.5、5、7.5、10、20 μmol/L,對(duì)照組不加,按濃度于96孔板上設(shè)置12排/板,共設(shè)置10個(gè)板;分別于0、12、24、48、72小時(shí)取出96孔板,每孔加入5 mg/ml MTT 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)上清;每孔加入150 μl DMSO:無水乙醇=1:1的混合液震蕩10分鐘,使結(jié)晶物充分溶解;在酶標(biāo)儀上,以波長(zhǎng)570 nm測(cè)定各孔光密度(Optical density,OD)值;以(OD測(cè)定孔-OD空白孔)表示每組的實(shí)際OD值;以正常對(duì)照組的細(xì)胞活力為100%,各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力=OD實(shí)驗(yàn)組的實(shí)際值/OD對(duì)照組的實(shí)際值。

      3 結(jié) 果

      與對(duì)照組相比,不同濃度的DAPT(0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00μmol/L)對(duì)DM大鼠VSMCs有抑制作用,這種抑制作用在0.15~7.50μmol/L濃度之間呈時(shí)間-濃度依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),7.50μmol/L濃度以上無明顯變化,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);根據(jù)作用曲線,各時(shí)間段DAPT對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率大約出現(xiàn)在0.15 ?mol/L和2.50 ?mol/L,且72小時(shí)時(shí)對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率較其余各時(shí)間段明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

      4 討 論

      糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者主要致殘、致死原因[4]。流行病學(xué)調(diào)查研究表明,糖尿病患者發(fā)生心腦血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)性較正常人增加34倍,血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)是動(dòng)脈壁的主要組成成分,在糖尿病血管并發(fā)癥的動(dòng)脈粥樣硬化形成中起著關(guān)鍵作用,因此對(duì)VSMC 的研究有著重要的意義。相關(guān)研究證明:Notch信號(hào)通路能促進(jìn)非糖尿病動(dòng)物缺血區(qū)的血管新生、動(dòng)靜脈分化等;本課題證明題DAPT對(duì)DM大鼠VSMCs有抑制作用,這種抑制作用在0.15~7.50μmol/L濃度之間呈時(shí)間-濃度依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),7.50 μmol/L濃度以上無明顯變化,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);根據(jù)作用曲線,各時(shí)間段DAPT對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率大約出現(xiàn)在0.15 ?mol/L和2.50 ?mol/L,且72小時(shí)時(shí)對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率較其余各時(shí)間段明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。證明Notch信號(hào)通路通過受體、配體、下游信號(hào)等各種蛋白共同作用下,在一定程度上可促進(jìn)糖尿病患者下肢缺血區(qū)的血管再生,隨著對(duì)Notch信號(hào)通路研究的深入和對(duì)血管新生影響機(jī)制的闡明以及促血管或抑制血管新生方法的不斷完善,一定能為相關(guān)血管疾病治療提供重要策略和新的靶點(diǎn)。

      參考文獻(xiàn)

      [1] 楊 婷,金 松,劉彥東.糖尿病大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2014, 21(2):173-176.

      [2] 司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)[M].第二版.北京:世界圖書出版社,2007.

      [3] 盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].第二版.北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999.439-441.

      [4] Laakso M. Hyperglycemia and cardiovascular disease in type 2 diabetes[J].Diabetes,1999,48(5):937-942.

      本文編輯:吳宏艷

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