孫雯雯 樓海 孫勤

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是指除結(jié)核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的一大類分枝桿菌的總稱，近年來隨著HIV等免疫缺陷性疾病和免疫抑制劑使用增多，以及國內(nèi)菌種鑒定技術(shù)的提高等因素，相當一部分痰涂片和(或)培養(yǎng)陽性的患者被鑒定為NTM肺病。世界衛(wèi)生組織[1]2017年公布的數(shù)據(jù)顯示，中國的結(jié)核病患者數(shù)量位列全球第三，僅次于印度和印度尼西亞。我國臨床觀察到的NTM肺病呈明顯增多趨勢，NTM 分離率由1979年的4.3%上升至 2000 年的 11.1%，至 2010 年已達 21.0%[2]，已成為威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題之一[1]。

由于NTM對抗結(jié)核藥物特別是一線抗結(jié)核藥物耐藥率非常高[3]，治療困難，復發(fā)率高，成為臨床醫(yī)師面臨的一大難題。利福布汀(rifabutin, Rfb)為利福霉素衍生物，體外研究證實對多種NTM菌株特別是鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復合群(Mycobacteriumavium-intracellulare complex, MAC)、堪薩斯分枝桿菌等緩慢生長型非結(jié)核分枝桿菌(slowly growing mycobacterium, SGM)耐藥率較低[4-7]，國內(nèi)外均已被相關(guān)指南推薦應用于HIV并發(fā)MAC感染的預防和治療[7-10]。但目前關(guān)于Rfb治療NTM肺病臨床療效的相關(guān)研究較少[9]，本研究采用回顧性分析方法探討含Rfb方案治療SGM肺病的近期療效及安全性。

資料和方法

一、研究對象

選取上海市肺科醫(yī)院2013年1月至2014年12月期間住院確診為NTM肺病、且進行規(guī)律治療并隨訪至停藥、臨床資料完整的患者124例，收集所有患者臨床資料并建立數(shù)據(jù)庫。患者入選標準：(1)細菌學確診為NTM肺病，年齡16～80歲，HIV陰性。(2)所有患者均為臨床高度懷疑NTM者，經(jīng)痰或支氣管肺泡灌洗標本進行PCR反向雜交法進行菌種鑒定并明確了致病菌菌種為SGM。(3) 所有患者為初次診斷為NTM肺病，抗結(jié)核藥物治療時間最長不超過2個月。(4)所有患者均在醫(yī)師指導下進行規(guī)律治療1年以上且臨床資料齊全。同時患有NTM肺病和肺結(jié)核或資料不全者予以排除。NTM肺病患者根據(jù)我國2012年《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識》[1]的標準確定診斷：(1)痰NTM培養(yǎng)2次均為同一致病菌。(2)支氣管肺泡灌洗液(BALF)NTM培養(yǎng)或者分子檢測陽性，且陽性度“++”以上；(3)BALF NTM培養(yǎng)或者分子檢測陽性，抗酸桿菌涂片陽性度“++”以上。(4)經(jīng)支氣管鏡或其他途徑肺組織活檢發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病肺組織病理特征(肉芽腫性炎或者抗酸染色陽性)，并且NTM培養(yǎng)或者分子檢測陽性。(5)肺組織活檢發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病肺組織病理特征(肉芽腫性炎或者抗酸染色陽性)，且痰標本或者BALF中NTM培養(yǎng)或者分子檢測陽性。

二、分枝桿菌培養(yǎng)藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)和菌種鑒定

入選患者均采用BACTEC MGIT960分枝桿菌快速液體培養(yǎng)法行分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗：收集經(jīng)4%NaOH溶液處理的痰標本1～2 ml，取0.1 ml 接種于酸性羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)斜面上，每份標本分別接種2支，置于37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～8周，記錄培養(yǎng)結(jié)果。MGIT960液體培養(yǎng)系統(tǒng)和分枝桿菌藥敏試驗試劑盒(鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卷曲霉素、阿米卡星)及藥敏試驗添加劑由美國BD公司生產(chǎn)。將痰標本按照BACTECTMMGIT操作規(guī)范(MGITTMProcedure Manual)進行培養(yǎng)和藥敏試驗。

菌種鑒定：主要儀器為基因擴增儀(德國Eppendorf Mastercycler Gradient PCR儀)、恒溫水浴箱 (上海躍進醫(yī)療器械廠，HETW21600)、分子雜交箱(韓國FinePCR，Combi-H12)?；颊咛祷蛑夤芄嘞匆簶吮居傻习采镉邢薰静捎梅种U菌菌種鑒定基因檢測試劑盒(亞能生物技術(shù)有限公司提供)進行PCR-反向點雜交法進行NTM菌種鑒定。

三、療效判定

1. 細菌學判定：分別于抗NTM治療后3、6、12個月末進行痰或者支氣管灌洗液分枝桿菌涂片和培養(yǎng)，觀察NTM的陰轉(zhuǎn)率。

2. 影像學(胸部CT平掃)判定：病變范圍以所有病灶相加占整個肺野的比例計算。(1)治療后病灶變化。①明顯吸收：病灶吸收≥1/2原病灶；②吸收：病灶吸收<1/2原病灶；③不變：病灶無明顯變化；④惡化：病灶擴大或播散。本研究將病灶的影像學療效判定分為病灶吸收(①+②)、無效(③+④)2個等級。(2)治療后空洞變化。①閉合：空洞閉合；②縮小：縮小≥原空洞直徑的1/2；③不變：縮小或增大<原空洞直徑的1/2；④增大：增大≥原空洞直徑的1/2。本研究將空洞的影像學療效判定分為：空洞吸收(①+②)、無效(③+④)2個等級。

3. 臨床療效判定：分為①治愈：肺部病灶無活動性，肺部空洞逐漸閉合，痰涂片及培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)。②顯效：痰涂片陰轉(zhuǎn)，病灶吸收明顯或吸收，肺部空洞已經(jīng)閉合或明顯縮小，上述情況均>3個月。③有效：痰涂片陰轉(zhuǎn)，肺部病灶明顯吸收、吸收或未見明顯吸收，空洞縮小，以上情況均>1個月。④無效(穩(wěn)定)：指治療前后病情穩(wěn)定無變化，痰涂片及影像學檢查也無明顯改變。⑤惡化：需要滿足下列條件之一，痰涂片陽轉(zhuǎn)；出現(xiàn)新發(fā)病灶；肺部空洞增大或出現(xiàn)新發(fā)空洞。⑥死亡。本研究將療效判定分為好轉(zhuǎn)(①+②+③)、失敗(④+⑤+⑥)2個等級。

四、研究設計

本研究為回顧性研究分析。研究對象分組：含Rfb組的治療方案中含Rfb，同時根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇含有異煙肼(0.3 g/d)；克拉霉素(0.5～1.0 g/d)、乙胺丁醇(0.75 g/d)；阿米卡星(0.4～0.6 g/d)、莫西沙星(0.4 g/d)；阿莫西林-克拉維酸鉀(1.0～2.0 g/d)等藥物中的數(shù)種作為方案組成；對照組為同期住院的患者，治療方案中不含Rfb，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇含異煙肼(0.3 g/d)、利福平(0.45～0.6 g/d)、乙胺丁醇(0.75 g/d)、克拉霉素(0.5～1.0 g/d)、阿米卡星(0.4～0.6 g/d)、莫西沙星(0.4 g/d)和阿莫西林-克拉維酸鉀(1.0～2.0 g/d)中的數(shù)種作為方案組成。其中阿米卡星只作為強化期治療藥物，使用最多6個月(根據(jù)患者耐受情況)，其余藥物均全程使用。以上藥物選擇原則依據(jù)MGIT 960培養(yǎng)藥敏試驗結(jié)果，遵循美國胸科協(xié)會文件[5]與我國《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識》[1]和就診患者經(jīng)管醫(yī)師的臨床經(jīng)驗，按照個體化治療方案，3、6、12個月痰菌未轉(zhuǎn)陰患者根據(jù)當時的藥敏試驗和患者耐受度調(diào)整治療方案，如痰菌陰轉(zhuǎn)、病灶穩(wěn)定好轉(zhuǎn)者進入鞏固期。比較兩組患者細菌學陰轉(zhuǎn)、影像學好轉(zhuǎn)和療效情況，以及不良反應發(fā)生情況。

五、兩組患者臨床基線特征的比較

入選的124例患者中，含Rfb組56例，其中男30例，女26例，年齡28～65歲，平均年齡(43.2±13.6)歲；56例菌株中，堪薩斯分枝桿菌20例、鳥分枝桿菌17例、胞內(nèi)分枝桿菌19例；對照組68例，其中男37例，女31例，年齡23～71歲，平均年齡(50.2±18.6)歲；68例菌株中，堪薩斯分枝桿菌24例、鳥分枝桿菌22例、胞內(nèi)分枝桿菌22例；兩組患者比較，性別(χ2=0.551，P>0.05)、年齡(t=1.055,P>0.05)差異均無統(tǒng)計學意義。治療前，兩組患者分別按病灶累及肺野數(shù)進行病灶廣泛程度的比較(t=1.524,P>0.05)，空洞發(fā)生率(χ2=0.384,P>0.05)及并發(fā)支氣管擴張情況(χ2=0.541,P>0.05)的比較，差異均無統(tǒng)計學意義。兩組患者在菌種分布上堪薩斯分枝桿菌(χ2=0.682,P>0.05)、鳥分枝桿菌(χ2=0.971,P>0.05)、胞內(nèi)分枝桿菌(χ2=1.128,P>0.05)等在分布上差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

六、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較，按計量資料采用t檢驗；計數(shù)資料采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、 兩組患者的痰菌陰轉(zhuǎn)率的比較

兩組痰菌陰轉(zhuǎn)率(為各痰菌檢測時間點累計陰轉(zhuǎn)率)在治療3個月末分別為：含Rfb組28.57%(16/56)，對照組26.47%(18/68)，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.452,P=0.512)；治療6個月末分別為：含Rfb組57.14%(32/56)，對照組51.47%(35/68)，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.125,P=0.112)；治療12個月末分別為：含Rfb組78.57%(44/56)，對照組69.12%(47/68)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.089，P=0.008)(表2)。

表1 治療前各種臨床基線特征在兩組患者中的比較

二、 兩組患者病灶吸收率和空洞吸收率比較

1. 病灶吸收情況：兩組病灶吸收率分別為含Rfb組75.00%(42/56)，對照組60.29%(41/68)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.523，P=0.009)(表3)。

2. 空洞吸收情況：兩組空洞吸收率分別為含Rfb組73.21%(41/56)，對照組63.24%(43/68)，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.952，P=0.094)(表3)。

三、 兩組患者臨床療效的比較

兩組臨床好轉(zhuǎn)率含Rfb組為73.21%(41/56)，對照組為60.29%(41/56)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.412，P=0.012)(表4)。

四、 兩組患者發(fā)生不良反應的比較

兩組患者在治療隨訪期間每月進行血常規(guī)、肝功能、腎功能復查，記錄不良反應，在入組患者中：含Rfb組出現(xiàn)白細胞減少7例，血小板降低3例，肝功能異常6例，胃腸道反應5例，不良反應發(fā)生率為37.50%；對照組出現(xiàn)白細胞減少6例，血小板降低1例，肝功能異常8例，胃腸道反應3例，不良反應發(fā)生率為26.47%。兩組不良反應發(fā)生率對比，含Rfb組顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=2.021，P=0.025)(表5)。

表2 不同痰菌檢測時間點兩組患者的痰菌陰轉(zhuǎn)情況

表3 不同影像學改變(病變吸收情況)在兩組患者中的比較

表4 不同臨床療效在兩組患者中的比較

表5 兩組患者不良反應發(fā)生情況比較

注括號外數(shù)值為“患者例數(shù)”，括號內(nèi)數(shù)值為“發(fā)生率(%)”

討 論

近年來，NTM肺病在全球的患病率呈快速增長趨勢[11]，在不少國家和地區(qū)已成為威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題之一，NTM肺病是最常見的臨床類型，我國近年的結(jié)核病流行病學調(diào)查(簡稱“流調(diào)”)顯示，NTM分離率逐年上升[2]，國外的大規(guī)模流調(diào)顯示，MAC是NTM感染患者最常見的定植菌群[12]，因此大多數(shù)臨床和體外試驗基于MAC開展；除此之外堪薩斯分枝桿菌和膿腫分枝桿菌亦是較為常見的致病菌[13]，這與我國2016年一項Meta分析納入的NTM菌種類型大致相仿，但菌種分布上仍存在一定的地域差別[14]。

NTM對常規(guī)抗結(jié)核藥物存在普遍耐藥，對一線抗結(jié)核藥物更是嚴重耐藥[15-16]。其耐藥機制復雜，包括天然的細胞壁屏障、藥物泵出系統(tǒng)、對藥物的滅活、藥物作用靶位點變異或缺失及質(zhì)粒等，且不同菌種NTM感染患者因其耐藥程度不同，治療的用藥和療程都不盡相同。因此，國內(nèi)外尚無針對NTM肺病的統(tǒng)一治療方案和療程，而目前NTM菌種鑒定和大規(guī)模相關(guān)的藥敏試驗評價體系尚未在基層普遍開展，臨床醫(yī)師在藥物合理選擇上面臨著一定困境，除了ATS指南[7]推薦對于NTM療效確定的新型大環(huán)內(nèi)酯類、乙胺丁醇外，利福霉素類藥物也是治療NTM肺病的常用藥物之一，特別是對于堪薩斯分枝桿菌的療效比較確定。Rfb與利福平的抗菌譜與抗菌機制相似，但其藥效學及藥代動力學卻明顯優(yōu)于后者：最低抑菌濃度MIC為利福平的1/16～1/8，低濃度即可抑制分枝桿菌的RNA合成，對大多數(shù)SGM具有抗菌活性[2,4-7]，尤其是對MAC和堪薩斯分枝桿菌具有較強的抗菌活性[6]。國外已臨床廣泛應用于MAC，特別是應用于HIV并發(fā)MAC感染的患者[7-9]。2016年一項中國大陸地區(qū)NTM耐藥情況的Meta分析中，共152篇文獻11 175株NTM菌株納入，該研究顯示我國NTM菌株體外藥敏試驗對Rfb的總體耐藥率為37.7%(16.5%～58.9%)，遠低于利福平[75.2%(73.7%～76.7%)]和利福噴丁[72.4(62.6%～82.2%)][11]。由于NTM分布與地理環(huán)境氣候相關(guān)，因此不同地區(qū)NTM菌種分布存在差異，可預見Rfb在SGM高發(fā)地區(qū)可能具有更大的應用前景。

在藥代動力學方面，Rfb是個親脂性藥物，具有極強的膜透功能，可濃集于中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞內(nèi)，形成細胞內(nèi)高濃度和低MIC，達到較高的組織-血漿濃度比，其在人體肺和肝中都具有較高濃度，細胞滲透能力較利福平強3～5倍，進而相對于利福平具有較高的殺菌及滅菌效果；在有關(guān)巨噬細胞的體外試驗中，在藥物去除24 h后，Rfb仍表現(xiàn)出強于利福平的細胞內(nèi)抗結(jié)核作用，這種長效的細胞內(nèi)抗菌活性驗證了其在胞內(nèi)抗分枝桿菌的療效。雖然利福霉素類藥物間具有高度的交叉耐藥性，但是利福平與Rfb之間卻為非完全性交叉耐藥；已有研究表明，約30%以上對利福平耐藥的分枝桿菌可能對Rfb敏感，其敏感度可能與利福平耐藥程度呈負相關(guān)[10]；國外已有體外試驗提示，Rfb對大部分利福平和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的MAC菌株敏感[17]。因此，可以大膽推測，在選擇治療方案時，即使存在利福平耐藥也可以考慮選擇Rfb作為治療方案的一部分，特別是在沒有菌種鑒定和對Rfb進行藥敏試驗的情況下；本研究結(jié)果顯示，含Rfb組在12個月末痰菌陰轉(zhuǎn)率、總體臨床好轉(zhuǎn)率方面均較對照組有明顯升高，這一結(jié)果基本符合上述文獻的研究結(jié)論。

有研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)體外藥敏試驗選擇的藥物用于治療NTM肺部感染可以迅速緩解癥狀，但無法達到長期痰涂片及培養(yǎng)的轉(zhuǎn)陰效果[5]，甚至有很多患者持續(xù)治療12個月后臨床癥狀仍存在。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因是多因素的，除了與NTM患者多存在肺部基礎疾病易反復感染外，還可能由于體外藥敏試驗敏感的藥物進入體內(nèi)后雖然可以快速有效地殺滅體液和組織液中的細菌，但對于寄生在巨噬細胞內(nèi)的細菌卻沒有那么好的抑制效果[18]。而Rfb屬于少數(shù)高效治療細胞內(nèi)病原體感染的抗菌藥物之一，試驗顯示Rfb抑制小鼠巨噬細胞內(nèi)鳥分枝桿菌生長的濃度僅為利福平的1/10，因此可能較利福平具有更持久穩(wěn)定的療效[18]。這一結(jié)論與本研究顯示的痰菌陰轉(zhuǎn)率方面，3、6、12個月末含Rfb組的痰菌陰轉(zhuǎn)率均高于對照組，且12個月末兩組差異具有統(tǒng)計學差異的研究結(jié)論相符；因此可以大膽推測，在遠期療效方案，含Rfb的化療方案可能有更高的價值，具有進一步研究的價值。

國外研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用Rfb在降低NTM復發(fā)，減少大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥方面亦具有一定價值[19]；并有體外試驗顯示，Rfb對于耐藥程度更為嚴重的膿腫分枝桿菌亦可能有效[20]；但目前國外多數(shù)大規(guī)模的臨床研究都基于HIV并發(fā)NTM(MAC)感染或者限于體外試驗[7-9,21]。我國在流行病學和菌種分布上與國外存在一定差異，發(fā)展中國家因?qū)嶒炇覘l件所限在菌種鑒定和藥敏試驗方面起步較晚且普及不夠，NTM菌種鑒定和相關(guān)藥敏試驗尚未大規(guī)模在基層開展，對Rfb的藥敏試驗開展不多，因此對于這一WHO推薦藥物臨床應用的資料極少；雖有研究表明，我國NTM菌株進行體外結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗對Rfb的總體耐藥率遠低于利福平和利福噴丁[14]，但體外試驗不能直接推測臨床療效，常規(guī)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗不能完全代表NTM的耐藥情況[1]，美國胸科協(xié)會指南[5]并不推薦對確診NTM感染的患者進行常規(guī)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗，筆者認為基于上述問題，對于這一經(jīng)典抗分枝桿菌藥物在我國的臨床應用有必要、也有價值去開展進一步的研究。

本研究兩組SGM患者中，均有一定比例患者出現(xiàn)不良反應，含Rfb組的不良反應發(fā)生率(白細胞、血小板降低，以及肝功能異常和胃腸道反應)明顯高于對照組，需引起臨床醫(yī)生的重視，對于含有Rfb方案進行治療的患者應定期隨訪血象，出現(xiàn)異常時則及時進行處理。

本研究不足之處在于該研究為回顧性分析，且納入的患者例數(shù)較少，很多患者由于臨床資料不全而予以剔除，可能引起資料的偏倚。因此，Rfb對于NTM中SGM感染的療效仍需進行大樣本、前瞻性、多中心的臨床研究去驗證。