譚毅剛 李嫣紅 鄭閩莉

由于器官移植、腫瘤、結(jié)締組織疾病等需接受免疫抑制藥物治療患者的免疫功能降低，導(dǎo)致免疫損害宿主(immunocompromised host，ICH)易并發(fā)結(jié)核感染。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，ICH并發(fā)肺結(jié)核患者的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特征與普通細(xì)菌感染相似，影像學(xué)分析及結(jié)核菌素純蛋白衍生物試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“PPD試驗(yàn)”)對(duì)診斷結(jié)核病差異明顯，極易漏診和誤診[1-3]。近年來(lái)，以T細(xì)胞免疫為基礎(chǔ)的體外γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assays，IGRA)成為結(jié)核病免疫診斷技術(shù)的重要突破，其中結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)成為具有較好特異度和敏感度的重要檢測(cè)手段[4]。然而其在需要采用免疫抑制劑治療的患者并發(fā)結(jié)核病時(shí)的檢測(cè)效果少見(jiàn)報(bào)道，故筆者嘗試分析此類(lèi)患者采用血T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象的來(lái)源和分組

回顧性收集廣州市胸科醫(yī)院2013年7月至2015年12月收治的因基礎(chǔ)疾病使用免疫抑制劑(如糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒藥物等)治療6個(gè)月以上，且并發(fā)肺結(jié)核的初治患者197例(簡(jiǎn)稱(chēng)“觀察組”)；收集同期200例未使用免疫抑制劑的初治肺結(jié)核患者(簡(jiǎn)稱(chēng)“對(duì)照組”；與觀察組患者為相鄰住院號(hào)的患者，若相鄰住院號(hào)患者不符合入選標(biāo)準(zhǔn)，則順延住院號(hào)選擇患者)的臨床資料。所有患者外周血檢測(cè)的CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)均低于正常數(shù)值下限。

觀察組患者中，男107例(54.3%)，女90例(45.7%)；年齡15～84歲，平均年齡(43.0±15.2)歲；基礎(chǔ)疾病包括腎移植者44例、腎病綜合征41例、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎40例、系統(tǒng)性紅斑狼瘡72例。對(duì)照組患者中，男126例(63.0%)，女74例(37.0%)；年齡18～81歲，平均年齡(45.5±17.6)歲。兩組患者均排除患有糖尿病、腫瘤、HIV感染等其他疾病，同時(shí)均排除確診為耐多藥結(jié)核病的患者。

二、肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]

通過(guò)痰液或支氣管灌洗液(BALF)的涂片或培養(yǎng)查找抗酸桿菌，對(duì)陽(yáng)性菌株行菌種鑒定以排除非結(jié)核分枝桿菌，結(jié)合胸部X線攝影檢查符合活動(dòng)性肺結(jié)核表現(xiàn)；菌陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。

三、檢測(cè)方法

1．外周血T-SPOT.TB檢測(cè)方法及結(jié)果判定：選用T-SPOT.TB(Oxford Immunotec公司，英國(guó))試劑盒，從外周靜脈血中分離出單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每個(gè)預(yù)包被抗γ干擾素抗體的孔中加入2.5×105個(gè)PBMC，分別與兩種抗原[早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)分泌蛋白10(CFP-10)]共同孵育16～20 h，使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)讀板儀對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)如果空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)<6個(gè)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)>6；(2)如果空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)必須>2倍的空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。反之，為陰性結(jié)果。陰性或陽(yáng)性對(duì)照異常，試驗(yàn)均視為無(wú)效。

2．抗酸桿菌金胺O熒光染色涂片鏡檢(簡(jiǎn)稱(chēng)“金胺O涂片鏡檢”)：用接種環(huán)挑取痰液或支氣管灌洗液中干酪樣膿樣或帶血小塊，制成厚涂片，自然干燥，染色前火焰固定。將制好的涂片用金胺O溶液染色，加溫促使菌體著色，3%鹽酸乙醇脫色，然后用高錳酸鉀溶液復(fù)染，置含有紫外光源的熒光顯微鏡下檢查，抗酸桿菌會(huì)發(fā)出閃亮的橘黃色，則為陽(yáng)性。

3．結(jié)核分枝桿菌快速液體培養(yǎng)及菌種鑒定：結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)操作程序嚴(yán)格按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)編著的《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]要求進(jìn)行，采用BACTEC MGIT 960(簡(jiǎn)稱(chēng)“MGIT 960”)系統(tǒng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)，以對(duì)硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)鑒別培養(yǎng)基初步菌株鑒別結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌。

4．PPD試驗(yàn)：所有研究對(duì)象在采血后，使用Mantoux法在前臂皮內(nèi)注射PPD 0.1 ml(5 IU)，72 h 檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，用直尺量取硬結(jié)平均直徑并記錄。若硬結(jié)平均直徑≥5 mm為陽(yáng)性，≥15 mm為強(qiáng)陽(yáng)性，以紅腫硬結(jié)平均直徑≥15 mm作為判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

觀察組臨床確診的197例患者中，外周血T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性為168例，陰性為29例，即陽(yáng)性率和敏感度均為85.28%；分泌物金胺O涂片鏡檢找分枝桿菌陽(yáng)性為72例，陰性為125例；分泌物分枝桿菌MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性106例，經(jīng)菌種鑒定均為結(jié)核分枝桿菌；PPD試驗(yàn)陽(yáng)性者68例，陰性者129例。對(duì)照組臨床確診的200例患者中，外周血T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性為192例，陰性為8例；分泌物金胺O涂片鏡檢找分枝桿菌陽(yáng)性為71例，陰性為129例；分泌物MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性115例，經(jīng)菌種鑒定均為結(jié)核分枝桿菌；PPD試驗(yàn)陽(yáng)性者127例，陰性者73例。以臨床確診患者為標(biāo)準(zhǔn)，觀察組和對(duì)照組患者T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性率均明顯高于金胺O涂片鏡檢、分泌物MGIT 960培養(yǎng)、PPD試驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。兩組患者間T-SPOT.TB與PPD試驗(yàn)檢測(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05)。具體見(jiàn)表1。

討 論

由于長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素等各種免疫抑制劑的患者免疫功能下降，結(jié)核感染的發(fā)生率遠(yuǎn)高于普通人群，但其臨床表現(xiàn)及肺部影像學(xué)檢查多不典型，難以及時(shí)確診[7-8]，故筆者回顧性分析各檢測(cè)方法對(duì)需要采用免疫抑制劑治療的患者并發(fā)結(jié)核病時(shí)的檢測(cè)效果。

研究結(jié)果顯示，對(duì)照組和觀察組患者分泌物涂片及培養(yǎng)的陽(yáng)性率組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，提示傳統(tǒng)方法檢測(cè)兩組患者結(jié)核感染的能力無(wú)變化，對(duì)是否使用免疫抑制劑的結(jié)核病患者診斷價(jià)值一致；而在PPD試驗(yàn)檢測(cè)中，觀察組的陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，降低了對(duì)免疫抑制患者罹患結(jié)核病的診斷作用；有報(bào)道認(rèn)為，PPD試驗(yàn)可檢測(cè)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的免疫變態(tài)反應(yīng)，當(dāng)患者服用免疫抑制藥物時(shí)，可致機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)受到抑制，同時(shí)抑制了細(xì)胞的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致PPD皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性率較非免疫受損患者低[9]，故需陽(yáng)性率更高、檢驗(yàn)時(shí)間更短的檢測(cè)方法來(lái)輔助診斷。

目前，臨床應(yīng)用的IGRA技術(shù)主要有兩種：其一是采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunospot assay, ELISA)檢測(cè)全血中致敏T細(xì)胞再次受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放γ干擾素的水平，稱(chēng)為IGRA-ELISA；其二是采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)測(cè)定PBMC中能釋放γ干擾素的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，稱(chēng)為T(mén)-SPOT.TB。T-SPOT.TB是以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特有的ESAT-6和CFP-10抗原作為特異性抗原，當(dāng)已結(jié)核感染的患者再次接觸上述抗原時(shí)，患者PBMC中存在的結(jié)核特異T淋巴細(xì)胞受刺激分泌γ干擾素，通過(guò)測(cè)定PBMC中釋放γ干擾素的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，判斷是否結(jié)核感染，對(duì)輔助診斷活動(dòng)性結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)有一定參考價(jià)值。由于ESAT-6和CFP-10在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中缺失，故可以提高T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核病檢測(cè)的特異度。

表1 兩組患者各方法檢測(cè)的情況及比較

注括號(hào)外數(shù)值為患者例數(shù)，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為率(%)；a：為組內(nèi)T-SPOT.TB與各檢測(cè)方法陽(yáng)性率進(jìn)行的比較；b:為兩組間各檢測(cè)方法陽(yáng)性率的比較

本研究顯示，觀察組和對(duì)照組的血T-SPOT.TB檢測(cè)的陽(yáng)性率均明顯高于各組內(nèi)分泌物金胺O涂片鏡檢及MGIT 960培養(yǎng)、PPD試驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，與李同心等[10]報(bào)道相近。以上兩組患者血T-SPOT.TB檢測(cè)的陽(yáng)性率高達(dá)85.28%～96.00%，均遠(yuǎn)高于本組傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的陽(yáng)性率，提示T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性時(shí)較其他檢測(cè)方法有更好的判斷意義；同時(shí)在未使用免疫抑制劑的結(jié)核病患者中，血T-SPOT.TB檢測(cè)陰性結(jié)果對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的排除診斷具有較大意義[11]。

在本研究中，觀察組患者T-SPOT.TB陽(yáng)性率低于對(duì)照組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；可能與患者服用免疫抑制藥物后嚴(yán)重抑制了T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，或與T淋巴細(xì)胞數(shù)值下降有關(guān)，從而降低了觀察組的陽(yáng)性檢出率。據(jù)Leidl等[12]研究顯示，在HIV感染者中，隨著免疫狀態(tài)的降低，T-SPOT.TB檢測(cè)的假陰性率逐漸增高；另外，Yang等[13]也認(rèn)為CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)T-SPOT．TB的檢測(cè)結(jié)果起到很重要的作用，其陽(yáng)性率和CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正比，當(dāng)患者免疫抑制嚴(yán)重時(shí)，其T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)也下降。據(jù)鐘一鳴等[9]、沈圓兵等[14]在對(duì)結(jié)締組織疾病患者的研究中顯示，血T-SPOT.TB檢測(cè)的敏感度僅為70.5%，但對(duì)T-SPOT.TB診斷假陰性相關(guān)危險(xiǎn)因素分析中發(fā)現(xiàn)：年齡、糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的使用、淋巴細(xì)胞減少癥和低蛋白均不是T-SPOT.TB診斷假陰性的危險(xiǎn)因素。本研究顯示，觀察組患者血T-SPOT.TB的陽(yáng)性率較對(duì)照組低，其機(jī)制尚未完全清晰，有待進(jìn)行更多的相關(guān)研究。本研究觀察組患者血T-SPOT.TB檢測(cè)陰性率達(dá)14.72%，提示可能存在LTBI風(fēng)險(xiǎn)；故使用免疫抑制劑患者采用T-SPOT.TB檢測(cè)陰性時(shí)，不能完全排除結(jié)核分枝桿菌感染可能，會(huì)出現(xiàn)假陰性可能。

國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，血T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果與PPD試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果相同，可診斷患者存在結(jié)核感染，但不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI[15-16]；而對(duì)于肺部有病灶或疑似結(jié)核病患者，國(guó)內(nèi)有較多文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為，此類(lèi)患者血T-SPOT.TB檢測(cè)的陽(yáng)性率可達(dá)87.8%～96.0%，敏感度可達(dá)86.9%～90.9%[17-18]，與本研究觀察組和對(duì)照組血T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性率(85.28%和96.00%)相一致，可用于活動(dòng)性結(jié)核病的輔助診斷。且T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性率高達(dá)96.00%，高于本研究其他傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法的檢測(cè)陽(yáng)性率；提示對(duì)于既往無(wú)結(jié)核病病史、近期肺部出現(xiàn)活動(dòng)性病變而疑似肺結(jié)核，并且血T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的患者，通過(guò)鑒別診斷排除普通細(xì)菌感染、腫瘤及其他肺部疾病后，可考慮結(jié)核感染可能。

志謝廣州市胸科醫(yī)院譚守勇教授對(duì)本研究給予了多方面的指導(dǎo)