禤開智，陳藝瑋，紀(jì)少凡

(海南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南 ?？?570311)

水產(chǎn)品是大自然賦予人類的美味佳品，特別是食用魚類由于其蛋白質(zhì)含量豐富，脂肪含量較低，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，且味道鮮美，一直是現(xiàn)代人們餐桌上必不可少的美食。伴隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)于食用魚的新鮮程度和產(chǎn)品質(zhì)量都有了更高的要求，因此在長(zhǎng)途運(yùn)輸和保存過程中如何保證食用魚的品質(zhì)就成了大家最為關(guān)注的問題。

在長(zhǎng)途運(yùn)輸過程中，各種不確定的環(huán)境或人為不利因素均可能導(dǎo)致鮮活水產(chǎn)品產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)引起肉質(zhì)出現(xiàn)不同程度的損傷，甚至?xí)?dǎo)致水產(chǎn)品的直接死亡，使其口感變差，價(jià)值大幅降低。相關(guān)研究表明，改善水產(chǎn)品的生存環(huán)境，通過物理或化學(xué)手段來降低其體內(nèi)新陳代謝活動(dòng)，可以有效延長(zhǎng)水產(chǎn)品的存活時(shí)間，大幅提高水產(chǎn)品價(jià)值。麻醉劑因有良好的鎮(zhèn)靜作用，在運(yùn)輸過程中可以有效降低水產(chǎn)品的新陳代謝，減少機(jī)體損傷，因而人們很早就將各類麻醉劑引入鮮活水產(chǎn)品運(yùn)輸中，從而大大提高了水產(chǎn)品在運(yùn)輸過程中的存活率。目前，有報(bào)道的各國(guó)應(yīng)用于水產(chǎn)品?；畹穆樽韯┓N類很多，如：MS-222、苯佐卡因、利多卡因、普魯卡因、丁香酚、乙醚等。這些起效快、成本低的麻醉劑雖能達(dá)到提高運(yùn)輸成活率目的，但其對(duì)應(yīng)的殘留安全性問題亦不容忽視。各國(guó)及國(guó)際組織在結(jié)合藥物安全性評(píng)估研究基礎(chǔ)上，對(duì)于魚用麻醉劑的使用管理上各有差異。日本規(guī)定了水產(chǎn)品中丁香酚的殘留限量為0.05 mg/kg，美國(guó)和加拿大則禁止使用丁香酚作為魚用麻醉劑，歐盟和澳大利亞對(duì)水產(chǎn)品中苯佐卡因的使用制定了限量。美國(guó)FDA規(guī)定所有經(jīng)過MS-222麻醉的魚類必須經(jīng)過21 d的藥物消退期才可上市出售，還發(fā)布了不當(dāng)使用苯佐卡因可能引起人體高鐵血紅蛋白血癥的警示信息。但我國(guó)目前針對(duì)此類魚用藥物的安全性相關(guān)法規(guī)、研究和管理信息尚存空缺，GB 2760和GB 2762最新版均未明確規(guī)定其在食品中的最大殘留限量。為切實(shí)保障人們身體健康與生態(tài)環(huán)境，規(guī)范有序水產(chǎn)行業(yè)的健康發(fā)展出發(fā)，提高大眾對(duì)食品安全的認(rèn)知，及早對(duì)該類藥物的使用安全性及檢測(cè)分析顯得異常重要，其可有利于引導(dǎo)規(guī)范用藥，提升政府安全監(jiān)管水平。

目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)魚用麻醉劑的研究多為對(duì)其藥用制品中的含量、應(yīng)用于魚類中的麻醉效果、作用機(jī)制、方法應(yīng)用和對(duì)血液成分的分析研究，零星文獻(xiàn)限于水產(chǎn)品中單一麻醉劑的檢測(cè)，但能開發(fā)運(yùn)用液相色譜同時(shí)對(duì)水產(chǎn)品中多類麻醉劑進(jìn)行快速分析檢測(cè)的研究尚未有報(bào)道。為此，本文在檢測(cè)對(duì)象上選取傳統(tǒng)魚用麻醉劑和新類型麻醉劑相結(jié)合的方式建立了超高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)魚肉中苯佐卡因、利多卡因、普莫卡因、普魯卡因、丁香酚、丁卡因和布他卡因7種麻醉劑殘留量的方法，其具有推廣性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度足夠、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。能為我國(guó)后續(xù)的食用水產(chǎn)品的麻醉劑質(zhì)量安全監(jiān)管提供一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚、金鯧魚和鰻魚(購自?？谑?、臨高縣、文昌市某水產(chǎn)市場(chǎng))：取肌肉可食部分進(jìn)行高速均質(zhì)制樣，置于-18 ℃下保存?zhèn)溆茫瑱z測(cè)時(shí)提前自然解凍至室溫；苯佐卡因標(biāo)準(zhǔn)品(benzocaine,CAS號(hào)：94-09-7，純度98%，德國(guó)DR.公司)、利多卡因標(biāo)準(zhǔn)品(lidocaine,CAS號(hào)：137-58-8，純度99.5%，德國(guó)DR.公司)、普莫卡因標(biāo)準(zhǔn)品(pramoxine,CAS號(hào)：637-58-1，純度99%，美國(guó)sigma公司)、普魯卡因標(biāo)準(zhǔn)品(procaine,CAS號(hào)：51-05-8，純度99.5%，德國(guó)DR.公司)、丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(eugenol,CAS號(hào)：97-53-0，純度99.5%，德國(guó)DR.公司)、丁卡因標(biāo)準(zhǔn)品(tetracaine,CAS號(hào)：94-24-6，純度99.8%，德國(guó)DR.公司)、布他卡因標(biāo)準(zhǔn)品(butacaine,CAS號(hào)：149-15-5，純度100%，美國(guó)USP公司)；甲醇、乙腈、正己烷：色譜純，TEDIA公司；HLB固相萃取小柱(150 mg/6 mL，WATERS公司)：使用前依次以5 mL甲醇、5 mL水活化，保持柱體濕潤(rùn)；無水硫酸鎂、氯化鈉；磷酸：分析純；5%甲醇水：量取5 mL甲醇，加水定容至100 mL；實(shí)驗(yàn)用水：超純水。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別準(zhǔn)確稱取7種標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解于棕色容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：分別移取適量的單標(biāo)溶液于同一容量瓶中，用甲醇配制成5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，0～4 ℃避光保存。臨用時(shí)用流動(dòng)相配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀(UPLC)，配有紫外檢測(cè)器，美國(guó)WATERS公司；MS3漩渦混合器，德國(guó)IKA公司；320R快速離心機(jī)，德國(guó)UNIVERSAL公司；2 500旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)海道夫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取 稱取5 g試樣(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞離心管中，加入3 mL水和15 mL乙腈渦旋提取5 min，再加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，渦旋震蕩2 min，而后以9 000 r/min離心3 min，吸取上層乙腈提取液轉(zhuǎn)至另一50 mL離心管中。

1.3.2 凈化 提取液中加入10 mL正己烷，渦旋1 min，以9 000 r/min離心3 min，棄去上層正己烷，將下層乙腈置于氮?dú)獯蹈蓛x中，40 ℃濃縮至大約1 mL，加入7 mL純水稀釋混勻，以小于1 mL/min的流速過已活化好的HLB柱，待樣液完全流出后，用5 mL 5%甲醇水淋洗柱體，棄去全部流出液，抽干，以5 mL甲醇洗脫，將收集的洗脫液于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加流動(dòng)相定容到1 mL，過0.22 μm水性濾膜，供液相色譜測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：waters acquity C18SB柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：乙腈:0.05%磷酸水(25:75)；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm和290 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品基質(zhì)的選擇

本方法選取的羅非魚、金鯧魚、鰻魚均為當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)消費(fèi)量、出口量及養(yǎng)殖規(guī)模占比大的代表性品種。且羅非魚為淡水養(yǎng)殖和脂肪含量低，鰻魚的脂肪量相對(duì)較高，金鯧魚為海水養(yǎng)殖品種。因此檢測(cè)基質(zhì)能滿足通用性、多樣性和復(fù)雜性的要求。

2.2 前處理提取條件的選擇

7種藥物均易溶于有機(jī)溶劑，但苯佐卡因和丁香酚不易溶于水。故本方法選取了乙腈、甲醇和乙酸乙酯3種實(shí)驗(yàn)室常規(guī)易獲取的有機(jī)試劑作為提取液來比較提取效果。經(jīng)過試驗(yàn)，乙酸乙酯提取率不及前兩者，且對(duì)脂類物質(zhì)的提取過多易形成乳化現(xiàn)象，影響后續(xù)的濃縮和凈化步驟；乙腈和甲醇的提取回收都較好，但用乙腈提取對(duì)動(dòng)物性基體具有沉淀蛋白效果，可減少雜質(zhì)進(jìn)入提取液的優(yōu)點(diǎn)，有利于后續(xù)凈化的簡(jiǎn)化以縮短檢測(cè)耗時(shí)。因而確定乙腈作為提取劑，提取的同時(shí)借鑒QuEChERS技術(shù)，加入氯化鈉和硫酸鎂來改善提取凈化效果，提高前處理效率減少后續(xù)的濃縮乙腈提取液的時(shí)間。

表1 不同柱子的平均回收率比較

2.3 凈化方式的選擇

圖1 洗脫液體積對(duì)比Fig.1 Recoveries comparation of different proportion of eluant volume

選用商品化固相萃取小柱凈化是當(dāng)前藥物殘留分析的主要凈化方式，實(shí)驗(yàn)除了使用正己烷進(jìn)行液液萃取除脂，再結(jié)合固液萃取操作，以最大限度的減少待測(cè)物中的干擾物。實(shí)驗(yàn)比較了相同規(guī)格的HLB、C18、MCX和堿性氧化鋁小柱的凈化回收效果(表1)。結(jié)果表明HLB固相萃取柱的萃取效率最高，C18固相萃取柱次之，MCX柱和堿性氧化鋁柱最差。同時(shí)，為防止固相萃取柱發(fā)生過載現(xiàn)象，對(duì)比了兩種規(guī)格150 mg/6 mL和60 mg/3 mL HLB固相萃取柱的吸附能力，結(jié)果表明，對(duì)于大容量樣液150 mg/6 mL HLB固相萃取柱的回收率保持在70%以上，60 mg/3 mL的HLB固相萃取柱的回收率在68%～85%，且60 mg/3 mL HLB固相萃取柱由于柱體小，容易出現(xiàn)柱堵塞情況。因此本方法采用150 mg/6 mL HLB固相萃取柱為凈化柱。

2.4 洗脫液體積的確定

為最大限度節(jié)省有機(jī)試劑使用量同時(shí)又能確保目標(biāo)物的回收率，將5 g空白樣品按1.3.1法提取，提取液中加入7種藥物混標(biāo)，過HLB柱，采用不同體積的甲醇進(jìn)行洗脫回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明用5 mL甲醇做洗脫液，能將7種藥物完全洗脫下來，故確定洗脫液體積為5 mL(圖1)。

2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別配制一定濃度的7種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用紫外檢測(cè)器做190～540 nm吸收光譜掃描可知，利多卡因、普莫卡因、丁香酚在200 nm附近有最大吸收峰，苯佐卡因、普魯卡因、丁卡因、布他卡因在290 nm附近有最大吸收峰，為便于歸類檢測(cè)，故確定同時(shí)檢測(cè)200 nm和290 nm的雙波長(zhǎng)(圖2～圖4)。

2.6 流動(dòng)相及其他參數(shù)的確定

本方法嘗試甲醇/水、乙腈/水、甲醇/0.1%磷酸水、乙腈/0.1%磷酸水、乙腈/0.05%磷酸水溶液作流動(dòng)相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)純水作載體峰型過寬且容易有拖尾現(xiàn)象，而加了酸后峰型明顯改善，但考慮到0.1%磷酸水的pH值過低，長(zhǎng)期使用極易損傷色譜柱而降低其耐用性。因此，選用乙腈：0.05%甲酸水(25∶75)作流動(dòng)相。

圖2 不同項(xiàng)目的全掃描波長(zhǎng)圖Fig.2 Full scan wavelength graph of 7 anesthetics

圖3 利多卡因、普莫卡因、丁香酚標(biāo)準(zhǔn)譜圖Fig.3 Standard LC chromatography graph of Lidocaine、pramoxine and eugenol

圖4 苯佐卡因、普魯卡因、丁卡因、布他卡因標(biāo)準(zhǔn)譜圖Fig.4 Standard LC chromatography graph of benzocaine、procaine、tetracaine and butacaine

2.7 線性范圍與定量限

配制7種麻醉劑質(zhì)量濃度為0.10，0.20，0.50，0.80，1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線來進(jìn)樣測(cè)定，以橫坐標(biāo)(x)為進(jìn)樣濃度，縱坐標(biāo)(y)為峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以10倍信噪比作定量限，考察方法靈敏度。所得線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表2。結(jié)果表明，在0.10～1.0 μg/mL 7種麻醉劑呈良好線性，決定系數(shù)R2均大于0.99，方法定量限為20 μg/kg，完全滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)品該類藥物的定量分析需要。

圖5 不同基質(zhì)樣品的加標(biāo)對(duì)比Fig.5 LC Chromatogram of blank sample and blank sample added with standard solution

化合物Chemical compound線性方程Regression equation決定系數(shù)R2定量限LOQ/(μg·kg-1)利多卡因 LidocaineY=1.44e+002X0.999 720普莫卡因 PramoxineY=9.36e+001X0.999 020丁香酚 EugenolY=2.91e+002X0.999 720苯佐卡因 BenzocaineY=1.38e+002X0.999 920普魯卡因 ProcaineY=5.75e+001X0.998 720丁卡因 TetracaineY=6.22e+001X0.998 820布他卡因 ButacaineY=6.64e+001X0.999 820

由圖5的基質(zhì)空白和按定量限加標(biāo)對(duì)比可知，經(jīng)過前處理的不同基質(zhì)樣品，檢測(cè)化合物出峰時(shí)間并無雜質(zhì)峰干擾，基線平穩(wěn)，峰形良好，響應(yīng)足夠。說明此方法適用于對(duì)食用經(jīng)濟(jì)魚類中7類麻醉劑殘留的檢測(cè)。

2.8 回收率、精密度

取空白魚肉樣品分別做0.020，0.040，0.100 mg/kg 3種添加水平，每一水平設(shè)6平行，同時(shí)設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，驗(yàn)證樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)(n=6)

由表3可以看出，7種麻醉劑在3個(gè)添加水平范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率在75.2%～98.6%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在2～10。方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，均符合殘留分析的要求。

3 結(jié) 論

本文建立的水產(chǎn)品中7種麻醉劑殘留測(cè)定的檢測(cè)方法較國(guó)內(nèi)現(xiàn)有報(bào)道的檢測(cè)方法具有：檢測(cè)組分種類多且部分項(xiàng)目為首次開展檢測(cè)研究、利用超高效液相色譜創(chuàng)新性的開展多波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)技術(shù)使得方法檢出限低、前處理簡(jiǎn)便、凈化效果佳，所用試劑耗材和檢測(cè)儀器常規(guī)實(shí)驗(yàn)室均能配備，投入成本低，易于推廣實(shí)施，能滿足篩查和定量需求，為開展水產(chǎn)品中麻醉劑殘留安全管理和檢測(cè)殘留提供有效的技術(shù)支持。